InGenio Journal
Revista de Ciencias de la Ingeniería de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo
https://revistas.uteq.edu.ec/index.php/ingenio
e-ISSN: 2697-3642 - CC BY-NC-SA 4.0
Volumen 8 | Número 1 | Pp. 1–20 | Enero 2025
DOI: https://doi.org/10.18779/ingenio.v8i1.909
Recibido (Received): 2024/06/07
Aceptado (Accepted): 2024/11/20
Optimización de medios para producción de
bacteriocinas antimicrobianas obtenidas de BAL de
Chicha de chontaduro
(Optimization of media for the production of antimicrobial bacteriocins
obtained from BAL from Chicha de chontaduro)
Serpa Gavilánez Evelyn Marlein
, Viteri Uribe Brandon Fernando
,
Sungey Naynee Sánchez Llaguno
, Juan Alejandro Neira Mosquera
InGenio Journal
Revista de Ciencias de la Ingeniería de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo
https://revistas.uteq.edu.ec/index.php/ingenio
e-ISSN: 2697-3642 CC BY-NC-SA 4.0
Volumen 8 | Número 1 | Pp. 1–4 | Enero 2025 Recibido (Received): 2024/06/07
DOI: https://doi.org/
10.18779/ingenio.v8i1.909 Aceptado (Accepted): 2024/11/20
Optimización de medios para producción de
bacteriocinas antimicrobianas obtenidas de BAL de
Chicha de chontaduro
(Optimization of media for the production of antimicrobial bacteriocins
obtained from BAL from Chicha de chontaduro)
Serpa Gavilánez Evelyn Marlein
, Viteri Uribe Brandon Fernando ,
Sungey Naynee Sánchez Llaguno y Juan Alejandro Neira Mosquera
Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE, Sangolquí, Ecuador
emserpa@espe.edu.ec, bfviteri@ espe.edu.ec, snsanchez@espe.edu.ec, jneira1@espe.edu.ec
Resumen: Las bacterias ácido lácticas (BAL) son microorganismos anaeróbicos presentes
en bebidas fermentadas como la chicha de chontaduro. Son conocidas por su potencial de
sintetizar bacteriocinas que se utilizan como aditivo para la bioconservación de alimentos por
su capacidad antimicrobiana. La presente investigación tuvo como objetivo aislar y
caracterizar bacterias productoras de bacteriocinas en la chicha de chontaduro, bebida
fermentada tradicional de la región amazónica ecuatoriana, considerando distintos tipos de
sustratos (Glucosa-peptona y Fructosa-peptona), para su aplicación como agente
antimicrobiano. La caracterización fisicoquímica y microbiológica de la bebida fermentada
se realizó al tercer día y se aislaron las bacterias. La colonia BAL se identificó con pruebas
bioquímicas y morfológicas, se realizaron sistemas de fermentación suplementados con
Glucosa-peptona y Fructosa-peptona a distintas concentraciones: 0,5 %, 2 %, 5 % y 7 %, se
llevaron a cabo mediciones de los parámetros cinéticos, incluyendo pH, acidez, absorbancia
y grados Brix, a intervalos de 0, 24, 48 y 72 horas, con el fin de identificar las condiciones
óptimas para maximizar la producción de bacteriocinas mediante el análisis del crecimiento
bacteriano y la eficiencia del proceso de fermentación. Se evaluaron los parámetros cinéticos
para determinar el efecto del tipo y concentración de sustrato, así como el tiempo de
fermentación en la producción de bacteriocinas y se determinó el mejor tratamiento con un
diseño trifactorial A*B*C, obteniendo en total 32 tratamientos con tres repeticiones. La
actividad antimicrobiana se evaluó con el método de difusión de pozos para las tres bacterias
patógenas (Lysinibacillus macroides, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus). El
tratamiento más eficaz fue el 32, que consistió en fructosa peptona al 7 % +72 horas. Este
tratamiento mostró una mayor producción de bacteriocinas y una mejora en la eficiencia
fermentativa con los siguientes parámetros cinéticos: pH 3,53, acidez 0,30, absorbancia 3,49
y grados Brix 7,53. Se observó una correlación inversa entre el pH y la absorbancia,
reflejando un crecimiento bacteriano robusto, y una correlación directa entre acidez y
absorbancia, indicando una mayor producción de ácidos orgánicos. La fructosa favoreció la
producción de bacteriocinas, lo que resalta la importancia de ajustar adecuadamente los
sustratos. Además, factores como la temperatura y la presencia de inhibidores deben ser
evaluados en investigaciones futuras.
Palabras clave: bacteriocinas, BAL, fermentación, parámetros cinéticos.
Abstract: Lactic acid bacteria (LAB) are anaerobic microorganisms present in fermented
beverages such as chicha de chontaduro. They are known for their potential to synthesize
bacteriocins that are used as additives for food biopreservation due to their antimicrobial
capacity. The objective of this research was to isolate and characterize bacteriocin-producing
bacteria in chicha de chontaduro, a traditional fermented beverage from the Ecuadorian
Amazon region, considering different types of substrates (Glucose-peptone and Fructose-
peptone), for its application as an antimicrobial agent. The physicochemical and
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microbiological characterization of the fermented beverage was carried out on the third day
and the bacteria were isolated. The BAL colony was identified with biochemical and
morphological tests, fermentation systems supplemented with Glucose-peptone and
Fructose-peptone at different concentrations were performed: 0.5 %, 2 %, 5 % and 7 %,
measurements of kinetic parameters, including pH, acidity, absorbance and Brix degrees,
were carried out at intervals of 0, 24, 48 and 72 hours, in order to identify the optimal
conditions to maximize bacteriocin production by analyzing bacterial growth and the
efficiency of the fermentation process. Kinetic parameters were evaluated to determine the
effect of substrate type and concentration, as well as fermentation time on bacteriocin
production and the best treatment was determined with a trifactorial design A*B*C, obtaining
a total of 32 treatments with three replicates. The antimicrobial activity was evaluated with
the well diffusion method for the three pathogenic bacteria (Lysinibacillus macroides,
Staphylococcus aureus and Bacillus cereus). The most effective treatment was treatment 32,
which consisted of 7 % fructose peptone + 72 hours. This treatment showed higher
bacteriocin production and improved fermentation efficiency with the following kinetic
parameters: pH 3.53, acidity 0.30, absorbance 3.49 and Brix 7.53. An inverse correlation was
observed between pH and absorbance, reflecting robust bacterial growth, and a direct
correlation between acidity and absorbance, indicating increased production of organic acids.
Fructose favored the production of bacteriocins, highlighting the importance of properly
adjusting substrates. In addition, factors such as temperature and the presence of inhibitors
should be evaluated in future research.
Keywords: bacteriocins, LAB, fermentation, kinetic parameters.
1. INTRODUCCIÓN
Los conservantes son aditivos alimentarios utilizados para inhibir el crecimiento de
microorganismos como bacterias, mohos, hongos y levaduras, los cuales pueden comprometer la
seguridad del alimento y causar riesgos para la salud [1]. Al frenar el deterioro microbiológico,
los conservantes permiten prolongar la vida útil de los productos alimenticios. Estos compuestos
se clasifican en conservantes de origen natural y sintético, siendo los conservantes artificiales los
más usados en la industria alimentaria debido a su eficacia y estabilidad [2].
El marco regulatorio sobre el uso de conservantes químicos en alimentos está definido por
diversas normativas internacionales y locales, que establecen los límites máximos permisibles
para estos compuestos. A nivel global, el Codex Alimentarius, desarrollado por la Organización
de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial
de la Salud (OMS), proporciona estándares que garantizan la seguridad alimentaria [3]. En
América Latina, cada país adopta normativas específicas; en Ecuador, por ejemplo, la regulación
es gestionada por la Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria (ARCSA).
Entre los conservantes aprobados tanto por el Codex como por ARCSA se incluyen los
benzoatos, sorbatos, sulfitos y nitratos, compuestos ampliamente utilizados por su efectividad
para prevenir el crecimiento microbiano [3], [4]. No obstante, algunos de estos conservantes han
sido objeto de preocupación debido a estudios que sugieren posibles efectos adversos en la salud
cuando se consumen en exceso, lo que resalta la necesidad de regulaciones estrictas y un
monitoreo continuo de su uso.
Un estudio realizado por Afshar et al. [5] evidenció que el consumo prolongado de benzoato
de potasio (E212) puede inducir efectos teratogénicos en el desarrollo ocular de fetos de ratones
BALBC/c. De manera similar, Zengin et al. [6] evaluó el benzoato de sodio y el benzoato de
potasio, encontraron que ambos compuestos tienen efectos clastogénicos, mutagénicos y
citotóxicos en linfocitos humanos in vitro. Por otro lado, Tsay et al. [7] trataron larvas de pez
cebra con benzoato de sodio (E211) y encontraron que dosis elevadas (1400-1500 ppm) causaron
la muerte de los peces, además de provocar desalineaciones en las fibras musculares, alteraciones
en la inervación de axones motores y daños en los tubos pronéfricos. Además, Khan et al. [8]
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observó que la administración de benzoato de sodio en dosis de 200, 400 y 700 mg/kg de peso
corporal en ratas Wistar macho provocó un aumento significativo en los niveles de citocinas
inflamatorias, como TNF-α, IFN-γ, IL-1β e IL-6.
En el estudio realizado por Hrnčiarová et al. [9] se evaluaron los efectos del benzoato de sodio
(E211), nitrito de sodio (E250) y sorbato de sodio (E201) en cepas bacterianas aisladas de
muestras fecales frescas, reportando valores de IC50 de 0.7, 1.0, 1.2 y 1.4 mg/mL,
respectivamente. Los resultados mostraron que la exposición a estos aditivos alimentarios indujo
disbiosis en la microbiota intestinal humana, provocando una disminución en la diversidad
microbiana. Otro estudio con sorbato de sodio demuestra que es genotóxico para los linfocitos de
sangre periférica humana in vitro en concentraciones altas [10].
El sulfito de sodio (E221), otro aditivo químico de uso común ha demostrado tener efectos
adversos cuando la exposición es inadecuada o prolongada, desencadenando procesos como
apoptosis hepática, necroptosis y piroptosis en ratones y en células AML-12 [11].
El nitrito de sodio (E250), un conservante ampliamente utilizado en productos cárnicos, ha
generado controversia debido a su potencial toxicidad en dosis elevadas. Aunque es eficaz en la
preservación de alimentos, su accesibilidad y la rapidez con la que puede ser letal han contribuido
a su creciente uso en casos de suicidio, lo que ha suscitado preocupación en el ámbito de la salud
pública. La ingestión accidental de nitrito de sodio, aunque poco frecuente, suele estar asociada a
la preparación no controlada de alimentos caseros. Los síntomas clínicos como náuseas, vómitos
y taquicardia suelen ser leves debido a la baja cantidad ingerida. Sin embargo, en casos graves o
fatales, se observa cianosis y alteración de la conciencia, con un alto riesgo de mortalidad antes
de llegar al hospital, especialmente cuando se consumen dosis elevadas o existen enfermedades
crónicas subyacentes [12].
El uso extendido de conservantes sintéticos en la industria alimentaria ha generado
preocupación debido a sus posibles efectos adversos para la salud, como se ha observado en
estudios que vinculan compuestos como los benzoatos y sorbatos con efectos mutagénicos,
citotóxicos y teratogénicos. A pesar de la eficacia de estos conservantes en la preservación de
alimentos, el riesgo para la salud humana, especialmente cuando se consumen en exceso, plantea
la necesidad urgente de buscar alternativas más seguras. Esta problemática se agrava por el
creciente consumo de alimentos ultraprocesados que contienen estos conservantes, lo que
aumenta la exposición de la población a los riesgos mencionados. En respuesta a estas
preocupaciones y al creciente interés en alternativas más seguras, ha aumentado el desarrollo y la
adopción de conservantes naturales, como las bacteriocinas [13].
En los últimos 30 años, las bacteriocinas han generado un gran interés, tanto en la comunidad
científica como en el sector industrial, gracias a su capacidad para inhibir microorganismos
patógenos. Se han desarrollado diversas investigaciones en torno a su detección, producción,
purificación, mecanismo de acción, caracterización bioquímica, propiedades bactericidas,
microorganismos inhibidos o sensibles y aplicación segura en la bioconservación de alimentos
[14].
Las bacteriocinas son proteínas o péptidos tóxicos sintetizados por el ribosoma y se liberan
extracelularmente en la fase de crecimiento tardío y estacionario temprano [15], [16]. Entre los
principales géneros de bacterias grampositivas que sintetizan bacteriocinas se encuentran
Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Oenococcus, Leuconostoc,
Enterococcus, Weissella, Carnobacterium, Microbacterium, Aerococcus, Leptosphaeria,
Melissococcus, Tetragenococcus, Propionibacterium, Bifidobacterium y Vagococcus [17],[18].
[19].
Las bacteriocinas suelen ser péptidos catiónicos pequeños (<10 kDa), estables al calor,
anfifílicos y capaces de permeabilizar membranas celulares. Además de su actividad
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antimicrobiana, los microorganismos productores de bacteriocinas pueden aportar valor agregado
a los alimentos, mejorando su textura, valor nutricional y sabor [20]. Estas moléculas han
demostrado eficacia contra patógenos significativos, como Staphylococcus aureus, Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli y Clostridium botulinum [21].
El mecanismo de acción de las bacteriocinas se basa en su capacidad para unirse a receptores
específicos en la membrana celular de microorganismos patógenos. Esta interacción provoca la
formación de poros que aumentan la permeabilidad de la célula, lo que resulta en su muerte [22].
La producción de bacteriocinas está mediada por un sistema de control que comprende tres
componentes fundamentales: un péptido inductivo (o factor activador de feromonas), una
histidina quinasa transmembrana que actúa como receptor de feromonas, y un regulador de
respuesta. Por lo general, las bacteriocinas son sintetizadas por bacterias ácido-lácticas (BAL) en
forma de péptidos inactivos, que son transportados a la superficie celular durante la fase de
crecimiento exponencial. En este contexto, las bacteriocinas son activadas a través de un proceso
enzimático, donde los transportadores poseen un dominio N-terminal que facilita la escisión del
péptido guía, y un dominio C-terminal que participa en la hidrólisis del trifosfato de adenosina,
proporcionando así la energía necesaria para su activación [23], [24].
El presente trabajo se justifica en la búsqueda de alternativas más seguras y naturales,
centrándose en el potencial de las bacteriocinas producidas por BAL aisladas de la chicha de
chontaduro como agentes de bioconservación. La chicha de chontaduro, una bebida tradicional
de la región amazónica del Ecuador, no ha sido investigada a gran profundidad como fuente de
estos bioconservantes. Aunque la bebida también puede encontrarse en otros países de la región
andina, como Perú y Bolivia, y en zonas bajas de Brasil, Colombia, Venezuela, Chile y Argentina
[25], [26], su potencial en la industria alimentaria ha sido poco explorado. En este estudio se
analizaron los parámetros fisicoquímicos y microbiológicos de la chicha de chontaduro para
obtener información sobre las bacteriocinas producidas por bacterias ácido-lácticas (BAL)
aisladas de esta bebida. El objetivo fue determinar el sustrato más óptimo para el crecimiento y
la producción de bacteriocinas. Para ello, se implementaron sistemas de fermentación con
diferentes combinaciones de sustratos (Carbono-Nitrógeno). Adicionalmente, se llevó a cabo un
ensayo para evaluar la actividad antimicrobiana de las bacteriocinas obtenidas.
Esta investigación no solo responde a la necesidad de garantizar la seguridad alimentaria sin
comprometer la salud de los consumidores, sino que también se alinea con el creciente interés
social por alimentos más naturales y saludables. Además, la promoción de conservantes naturales
como las bacteriocinas fomentan prácticas de consumo más sostenibles y saludables,
respondiendo a la demanda actual de los consumidores por productos libres de aditivos
artificiales. Desde una perspectiva política y regulatoria, esta investigación también busca
contribuir a la adopción de normativas que promuevan el uso de conservantes naturales en lugar
de los sintéticos, alineándose con estándares internacionales como el Codex Alimentarius y las
regulaciones locales, como las emitidas por la ARCSA en Ecuador [3].
2. METODOLOGÍA
2.1. Obtención de la chicha de chontaduro
La bebida fermentada chicha de chontaduro utilizada en el presente proyecto de investigación
se adquirió de la Comuna Kichwa Juan Montalvo, ubicada en el cantón La Joya de los Sachas,
ubicada en la provincia de Orellana, Ecuador. Se evaluó una cantidad aproximada de 1100 mL de
la bebida. La chicha fue almacenada en un frasco de vidrio de 2000 mL cubierto con papel
aluminio para evitar la exposición a la luz directa, utilizando un sistema de fermentación con
trampa de agua que consistía en un tubo de plástico conectado a una botella adicional para permitir
la salida de los gases generados durante el proceso de fermentación. El almacenamiento se realizó
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a temperatura ambiente y en condiciones sin exposición directa a la luz, lo que garantizó un
entorno estable para la fermentación y minimizó posibles alteraciones externas.
2.2. Caracterización fisicoquímica y microbiológica de la chicha de chontaduro
Durante las primeras horas, la bebida inicia su fermentación y las bacterias acidolácticas
(BAL) se adaptan al medio (chicha de chontaduro), alcanzando un pico de actividad en su
crecimiento exponencial al tercer día. Por lo tanto, en este momento se midieron los parámetros
fisicoquímicos: pH por método directo utilizando un pH-metro de la marca BOECO Modelo BT-
700, acidez por el método de titulación para medir la acidez titulable, grados alcohólicos mediante
el uso de un alcoholímetro BOECO con un rango de 100 % Vol, densidad con el uso de un
picnómetro de 10 mL y grados Brix utilizando un refractómetro de mano BOECO de 45 °. Los
parámetros se midieron y se compararon de acuerdo con la Norma INEN 2262:2013 para bebidas
alcohólicas, a excepción de la densidad y grados Brix.
Se caracterizó microbiológicamente la bebida fermentada mediante la técnica de recuento en
placa, utilizando Petrifilm marca 3M para bacterias ácido lácticas (BAL), aerobios mesófilos,
mohos y levaduras. Como primer paso, se prepararon diluciones seriadas de la chicha de
chontaduro, utilizando como diluyente agua de peptona hasta la dilución 10⁻⁴, y se agregó 1 mL
de la disolución en el centro del film. Las placas de Petrifilm se colocaron en la incubadora digital
marca Memmert, modelo Incubadora I. Los Petrifilm de bacterias ácido-lácticas y aerobios se
incubaron durante 48 horas a 37 °C, mientras que los de mohos y levaduras se mantuvieron
durante 72 horas a 25 °C. Posteriormente, se contabilizaron utilizando un contador de colonias
Isolab (603.11.001). Las metodologías empleadas para la caracterización microbiológica se
rigieron y compararon con el manual del usuario de Petrifilm, marca 3M.
2.3. Aislamiento de las bacterias productoras de bacteriocinas
En el tercer día de fermentación, al fermentado se realizaron diluciones seriadas desde 10⁻1
hasta 10⁻⁴ utilizando agua de peptona al 1,5 %. De la dilución 10⁻⁴, se tomó 1 mL mediante una
micropipeta automática BrandTech de 100 µL para cada caja Petri que contenía 25 mL de agar
MRS. Las cajas se sellaron con parafilm y se incubaron a 37 °C durante 48 horas. Transcurrido
este período, se realizaron nuevas siembras empleando el método de estrías para purificar las
colonias.
2.4. Identificación de las colonias aisladas
Se llevó a cabo una identificación morfológica mediante tinción de Gram considerando que
las formas bacterias ácido-lácticas (BAL) corresponden principalmente a cocos y bacilos. La
reacción a la tinción, que se manifiesta en un color azul/morado, proporciona información sobre
la estructura de la pared celular, indicando que las BAL son grampositivas.
Para la tinción Gram, se esterilizaron en una autoclave Tuttnaver automática 2540- PG15E
todos los materiales a utilizar para no contaminar las placas con las colonias. Primero, se colocó
una gota de agua destilada en un portaobjetos. Luego, con un asa bacteriológica de metal, se tomó
una pequeña cantidad de la muestra bacteriana y se esparció por el portaobjetos. Para fijar la
muestra al portaobjeto se utilizó un mechero. Cuando la muestra secó, se cubrió con cristal violeta
por 60 segundos. Luego, se añadió lugol de igual manera por 60 segundos. Posterior a esto,
alcohol cetona durante 15 segundos. Finalmente, se colocó safranina y se dejó por 60 segundos.
En cada etapa se realizó un lavado con agua destilada y se secó con el mechero. Para visualizar
las placas, se utilizó un microscopio óptico Better Scientific BS750 a una resolución de 100x
colocando aceite de inmersión en la muestra del portaobjetos.
Además, se realizaron pruebas bioquímicas: en la prueba de catalasa se utilizó una gota de
peróxido de hidrógeno en el portaobjeto con la muestra bacteriana, donde la presencia de burbujas
confirmó la presencia de la enzima catalasa y en la prueba oxidasa se agregaron 3 gotas del
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reactivo Kovac en un papel filtro con la muestra siendo la coloración rosada, púrpura o negra un
resultado positivo para la enzima oxidasa, ayudando a diferenciar el grupo bacteriano.
2.5. Establecimiento de sistemas de fermentación bacteriana con distintos tipos de sustratos
y producción de bacteriocinas
La bacteria identificada se replicó una sola vez en caldo Man, Rogosa y Sharpe (MRS) y tras
48 horas, se establecieron los sistemas de fermentación. Inicialmente, se elaboraron los medios
en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 200 mL de medio de cultivo MRS y 2 mL de la muestra
bacteriana. En cada tratamiento, se añadió un sustrato (glucosa-peptona y fructosa-peptona) en
concentraciones de 0,5 %, 2 %, 5 % y 7 % p/v. Para la medición de los parámetros cinéticos,
como el % de acidez, pH, densidad óptica a 550 nm se utilizó el Espectrofotómetro Shimadzu
UV-1280 y grados Brix, se utilizó un equipo de muestreo (equipo de venoclisis), y las mediciones
se realizaron en diferentes intervalos de tiempo (0, 24, 48 y 72 horas). Finalmente, la fermentación
discontinua se incubó a 37 °C, sin agitación, durante 72 horas.
El estudio cinético realizado tiene como objetivo central identificar las mejores condiciones
para maximizar la producción de bacteriocinas a partir del crecimiento bacteriano y la eficiencia
del proceso de fermentación. Las variables medidas (pH, acidez, absorbancia y grados Brix)
permiten evaluar cómo los cambios en el tipo y concentración de sustrato, junto con el tiempo de
fermentación, afectan este proceso y ayudan a determinar las condiciones óptimas para la
producción de bacteriocinas.
2.6. Análisis estadístico
Para esta investigación se aplicó un diseño estadístico de bloques completamente
aleatorizados con un arreglo factorial ABC, donde se evaluaron tres factores: Factor A (Tipo de
Sustrato: Glucosa-peptona y Fructosa-peptona), Factor B (Concentración del Sustrato: 0,5 %, 2
%, 5 %, 7 %) y Factor C (Tiempo: 0, 24, 48, 72 horas) como se observa en la Tabla 1, con tres
repeticiones por tratamiento. El análisis estadístico se realizó exclusivamente con los parámetros
cinéticos, utilizando ANOVA para determinar diferencias significativas entre los tratamientos,
seguido de la prueba de Tukey (p<0,05) para la separación de medias. Los datos fueron
procesados utilizando el software STHATGRAPICS. Las variables evaluadas incluyeron pH,
acidez, densidad y grados Brix.
Se realizó un análisis de conglomerados jerárquico con el objetivo de agrupar los tratamientos
en función de sus similitudes, permitiendo identificar patrones y posibles relaciones entre los
diferentes niveles de glucosa, fructosa y peptona, así como los tiempos de incubación. Esto se
realizó para explorar si los tratamientos podían agruparse de forma coherente según su
proximidad, lo cual ayudaría a identificar patrones de comportamiento de las bacterias en función
de las condiciones experimentales.
Adicionalmente, se empleó un análisis de componentes principales (ACP) con el fin de
reducir la dimensionalidad de los datos y visualizar de forma clara la variabilidad entre los
tratamientos, resaltando las variables más influyentes en la diferenciación de los tratamientos.
Esto nos permite interpretar mejor las tendencias y patrones complejos en los resultados.
2.7. Obtención de las bacteriocinas
Los mejores tratamientos seleccionados según los parámetros cinéticos, fueron sometidos a
centrifugación a 10000 rpm durante 20 minutos en la Centrífuga modelo DM0412P. El
sobrenadante resultante se recolectó en un frasco de vidrio ámbar de 100 mL y se ajustó su pH
entre 6,0 y 6,5 utilizando NaOH a 1N, con el fin de neutralizar los ácidos orgánicos presentes.
Finalmente, el sobrenadante fue filtrado manualmente utilizando papel filtro de 0,22 μm para
obtener las bacteriocinas.
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Tabla 1. Interacciones respectivas con sus respectivos tratamientos (Tipo de sustratos,
concentración del sustrato y tiempo).
Tratamiento
Interacción
Combinación
T1
A0B0C0
T2
A0B0C1
T3
A0B0C2
T4
A0B0C3
T5
A0B1C0
T6
A0B1C1
T7
A0B1C2
T8
A0B1C3
T9
A0B2C0
T10
A0B2C1
T11
A0B2C2
T12
A0B2C3
T13
A0B3C0
T14
A0B3C1
T15
A0B3C2
T16
A0B3C3
T17
A1B0C0
T18
A1B0C1
T19
A1B0C2
T20
A1B0C3
T21
A1B1C0
T22
A1B1C1
T23
A1B1C2
T24
A1B1C3
T25
A1B2C0
T26
A1B2C1
T27
A1B2C2
T28
A1B2C3
T29
A1B3C0
T30
A1B3C1
T31
A1B3C2
T32
A1B3C3
2.8. Ensayos de actividad antimicrobiana de las bacteriocinas
Para evaluar la actividad antimicrobiana, se utilizó el método de difusión en pozos. Se preparó
previamente una solución salina que contenía tres microorganismos patógenos (Staphylococcus
aureus, Lysinibacillus macroides y Bacillus cereus), los cuales fueron proporcionados por el
laboratorio de microbiología de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Santo Domingo.
Estos microorganismos fueron aislados en dicho laboratorio y posteriormente enviados para su
procesamiento molecular, sin certificación por colecciones oficiales como ATCC o DSMZ.
El inóculo de cada patógeno se aplicó en cajas Petri que contenían el medio de cultivo Muller
Hinton Agar mediante el método de estría. A continuación, se aplicó el método difusión en pozos
de agar, donde se realizaron perforaciones en el agar utilizando un sacabocados y se depositaron
15 µL de bacteriocina en cada pozo. Finalmente, las placas se incubaron a 37 °C siendo la
temperatura óptima para cada microorganismo patógeno, y se midieron los halos de inhibición
(en milímetros).
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3. RESULTADOS
3.1. Caracterización de acuerdo con las propiedades fisicoquímicas y microbiológicas de la
bebida tradicional fermentada “chicha de chontaduro”
La caracterización de las propiedades fisicoquímicas (Tabla 2) y microbiológicas (Tabla 3)
obtenida de la bebida fermentada estudiada. Obteniendo un numero incontable en la identificación
de BAL de manera general.
3.2. Aislamiento e identificación de las bacterias productoras de bacteriocinas
Los resultados de las pruebas bioquímicas (Tabla 4) confirmaron que la colonia 1 pertenece
a un género de bacterias ácido-lácticas (BAL), ya que la tinción Gram resultó positiva, y las
pruebas de catalasa y oxidasa fueron negativas. La morfología observada bajo el microscopio
óptico a 100x reveló la presencia de bacilos. Aunque no se identificó la especie exacta, estas
características coinciden con géneros comunes de BAL como Lactobacillus, Pediococcus o
Leuconostoc, los cuales son típicos en procesos de fermentación. Sería necesario un análisis
molecular adicional, como secuenciación de ADN, para confirmar el género específico.
3.3. Crecimiento bacteriano en los sistemas de fermentación
Se evaluó el crecimiento de la colonia 1 en sistemas de fermentación a lo largo del tiempo,
utilizando la absorbancia como un indicador de la densidad celular. En la Figura 1, se presenta la
variación de la absorbancia a diferentes intervalos de tiempo (0, 24, 48 y 72 horas). La absorbancia
se determinó mediante un espectrofotómetro Shimadzu UV-1280, midiendo la densidad óptica a
550 nm. Este parámetro está directamente relacionado con la concentración de células en
suspensión, ya que a medida que las bacterias se multiplican, la turbidez de la solución aumenta,
reflejando un incremento en la absorbancia.
El análisis mostró una correlación significativa entre el tiempo y la absorbancia, con un
coeficiente de 0,97028, lo que indica un crecimiento exponencial durante las primeras fases de la
fermentación. Esta medición es clave para monitorear el desarrollo del cultivo bacteriano y
evaluar su actividad metabólica, ya que un aumento en la absorbancia sugiere un incremento en
la biomasa bacteriana, lo que es esencial para comprender la eficacia del sistema de fermentación.
Tabla 2. Propiedades fisicoquímicas de la chicha de chontaduro.
Acidez % (p/v)
pH
Densidad
°Alcohólicos
°Brix
0,23 g/L
4,5
1,00 g/mL
<5°
3
Tabla 3. Propiedades microbiológicas de la chicha de chontaduro.
Mohos y levaduras
Aerobios
Bacterias ácido lácticas
1E+4 UFC/mL
2,17E+6 UFC/mL
3E+6 UFC/mL
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Tabla 4. Colonia 1 pruebas bioquímicas.
Colonia
Tinción Gram
Catalasa
Oxidasa
Colonia 1 ( + ) Negativo
Negativo
Figura 1. Regresión Simple: Hora vs. Absorbancia.
3.4. Prueba de significación de Tukey (p<0,05) para la variable pH para mayor producción
de bacteriocinas
Se observó una variación significativa en los valores de pH a lo largo de los diferentes tiempos
de fermentación y concentraciones de sustrato como se evidencia en la Figura 2. El mayor valor
de pH se registró en el tratamiento con Fructosa-Peptona al 0,5 % y 0 horas, alcanzando un valor
de 6,21, lo que indica que este sistema mantuvo una baja acidez en las primeras etapas del proceso.
En contraste, el valor más bajo de pH se obtuvo en el tratamiento con Fructosa-Peptona al 7 % y
72 horas, con un valor de 3,53, lo que sugiere que a concentraciones más altas de fructosa y tras
tiempos prolongados de fermentación, se genera una mayor producción de ácidos, lo que provoca
una disminución del pH. Esta tendencia podría estar asociada al aumento en la producción de
compuestos ácidos como parte del metabolismo bacteriano en el sistema de fermentación.
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Figura 2. Prueba de significación de Tukey para pH (Interacción ABC: Tipo de
sustrato*concentración del sustrato*tiempo).
3.5. Prueba de significación de Tukey (p<0,05) para la variable acidez para mayor
producción de bacteriocinas
En la variable de acidez (g/L), se observó un comportamiento acorde con los cambios de pH,
donde los tratamientos con mayor concentración de sustrato y tiempos de fermentación
prolongados resultaron en mayores valores de acidez como se observa en la Figura 3. El mayor
valor de acidez fue registrado para el tratamiento con Fructosa-Peptona al 7 % y 72 horas,
alcanzando 0,30 unidades de acidez. Este resultado sugiere una correlación directa entre el tiempo
de incubación y la producción de ácidos en este sistema. Por otro lado, el valor más bajo de acidez
se obtuvo para el tratamiento con Glucosa-Peptona al 5 % y 0 horas, con un valor de 0,02
unidades, lo que es coherente con un proceso de fermentación recién iniciado donde aún no se ha
producido una cantidad significativa de ácidos.
Figura 3. Prueba de significación de Tukey para acidez (Interacción ABC: Tipo de
sustrato*concentración del sustrato*tiempo).
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3.6. Prueba de significación de Tukey (p<0,05) para la variable absorbancia para mayor
producción de bacteriocinas
La absorbancia, medida como un indicador de crecimiento celular y turbidez del medio,
mostró valores más altos conforme aumentaban la concentración del sustrato y el tiempo de
fermentación como se presenta en la Figura 4. En los tratamientos con fructosa, se observó que el
valor máximo de absorbancia fue 3,49, registrado para Fructosa-Peptona al 7 % y 72 horas, lo que
indica un mayor crecimiento bacteriano en este sistema. En contraste, el valor más bajo de
absorbancia fue de 0,565 para el tratamiento con Glucosa-Peptona al 0,5 % y 0 horas, lo que
refleja un crecimiento bacteriano limitado al inicio de la fermentación. La fructosa parece
favorecer una mayor proliferación bacteriana en comparación con la glucosa, lo que podría estar
relacionado con la capacidad de la bacteria para metabolizar este sustrato de manera más eficiente
bajo las condiciones experimentales.
Figura 4. Prueba de significación de Tukey para absorbancia (Interacción ABC: Tipo de
sustrato*concentración del sustrato*tiempo).
3.7. Prueba de significación de Tukey (p<0,05) para la variable grados brix
Los grados Brix, una medida de la cantidad de sólidos disueltos (principalmente azúcares),
presentaron una tendencia creciente con el tiempo y la concentración de sustrato, lo cual se detalla
en la Figura 5. El valor más alto de Brix, 10,30, se obtuvo en los tratamientos de Fructosa-Peptona
al 7 % y Glucosa-Peptona al 7 % a 0 horas. Esto indica que, al inicio de la fermentación, ambos
sustratos presentaban una alta concentración de azúcares disponibles. A medida que avanzaba el
tiempo de fermentación, los grados Brix disminuyeron debido al consumo de azúcares por parte
de las bacterias. El valor más bajo fue 2,53, observado en Fructosa-Peptona al 0,5 % y 72 horas,
lo que sugiere que una mayor duración de la fermentación y concentraciones bajas de sustrato
llevan a una mayor utilización de los azúcares por las bacterias.
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Figura 5. Prueba de significación de Tukey para grados brix (Interacción ABC: Tipo de
sustrato*concentración del sustrato*tiempo).
3.8. Análisis de conglomerados
En la Figura 6 se observa el dendograma mediante un clúster jerárquico que muestra
similitudes entre los tratamientos de estudio. Se obtuvo mayor relación entre los tratamientos
Fructosa-peptona + 0,5 % + 72 horas, Fructosa-peptona + 5 % + 48 horas, Glucosa-peptona + 0,5
% + 72 horas, Fructosa-peptona + 2 % + 48 horas, Fructosa-peptona + 7 % + 48 horas, Glucosa-
peptona + 5 % + 48 horas, Glucosa-peptona + 2 % + 48 horas y Glucosa peptona + 7 % + 48
horas. Por otra parte, los tratamientos que tienen menor proximidad de los demás tratamientos
son Fructosa-peptona + 2 % + 72 horas, Fructosa-peptona + 5 % + 72 horas, Fructosa-peptona +
7 % + 72 horas, Glucosa-peptona + 5 % + 72 horas, Glucosa-peptona + 2 % + 72 horas y Glucosa-
peptona + 7 % + 72 horas.
El análisis de conglomerados jerárquicos mostró que los tratamientos con tiempos de
incubación más largos (72 horas) tienden a agruparse de manera independiente de los tratamientos
con tiempos más cortos, lo cual sugiere que la duración de la incubación tiene un efecto
significativo en las características que diferencian a los grupos. Específicamente, los tratamientos
con 72 horas de incubación con fructosa y glucosa-peptona a diferentes concentraciones
presentaron menor proximidad con los tratamientos de 48 horas, lo que indica posibles
variaciones en la actividad bacteriana o la producción de bacteriocinas en esos periodos.
Por otro lado, los tratamientos con tiempos de incubación de 48 horas presentan mayor
similitud entre ellos, agrupándose independientemente de las variaciones en la concentración de
glucosa o fructosa. Esto sugiere que el tiempo de incubación es un factor determinante en la
diferenciación de los tratamientos, más allá de la concentración de los sustratos.
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Figura 6. Dendograma de los tratamientos en estudio.
3.9. Análisis de componentes principales
La Figura 7 presenta los resultados del análisis de los cuatro componentes evaluados durante
el sistema de fermentación. De acuerdo con el gráfico de sedimentación, se seleccionaron dos
componentes principales, ya que son los que explican la mayor parte de la varianza en los datos,
y tienen valores de varianza mayores a 1, según el criterio de Kaiser.
La Figura 8 muestra las correlaciones entre las variables brix, pH, acidez y absorbancia en un
espacio tridimensional utilizando el análisis de componentes principales (PCA). Se observa una
relación inversa entre el pH y la absorbancia, así como entre el pH y la acidez, mientras que la
acidez y la absorbancia muestran una leve relación directa. El primer componente (Componente
1) está fuertemente relacionado con el pH, que explica la mayor parte de la varianza en los datos,
mientras que el segundo componente (Componente 2) está más asociado con las variables Brix y
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acidez. Estos dos componentes principales fueron seleccionados porque capturan la mayoría de
las relaciones relevantes entre las variables. La absorbancia, aunque tiene una relación inversa
con el pH, se asocia en menor medida con el componente 3, que captura una fracción menor de
la varianza.
Figura 7. Gráfico de sedimentación del análisis de componentes principales.
Figura 8. Gráfico de componentes principales.
3.10. Análisis de la actividad antimicrobiana de las bacteriocinas obtenidas del proceso de
fermentación bacteriana
En la Tabla 5 se evidenció la actividad antimicrobiana mediante los halos de inhibición,
alrededor de los pozos sobre cada bacteria patógena. La bacteriocina que se empleó fue de la
mejor fermentación de cada sustrato en función de sus parámetros cinéticos microbianos.
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Tabla 5. Unidades arbitrarias del mejor tratamiento de cada tipo de sustrato.
Tratamiento
Lysinibacillu
s macroides
(AU/mL)
Staphylococcus
aureus(AU/mL)
Bacillus cereus
(AU/mL)
Glucosa-peptona + 5 % + 72 horas
263,9
214,3
229,7
Fructosa-peptona + 7 % + 72 horas
324,9
263
246,2
4. DISCUSIÓN
De acuerdo con la Norma Técnica NTE INEN 2262:2013 [27] para bebidas alcohólicas, el
pH debe estar entre 3,8 y 4,8, y la acidez no debe superar 0,3. La bebida estudiada cumple con
estos parámetros. Respecto a los grados Brix, el valor obtenido es 3, lo que indica un bajo
contenido alcohólico a las 72 horas de fermentación. Para lograr un mayor grado alcohólico, los
grados Brix deberían estar entre 5 y 22, ya que una mayor concentración de azúcar facilita la
fermentación alcohólica y, por ende, aumenta el porcentaje de alcohol en la bebida tradicional
[28]. Estudios recientes sugieren que la concentración de azúcares en el sustrato está
estrechamente relacionada con la eficiencia de la fermentación y la producción de alcohol. Estos
estudios sugieren que, al controlar el tipo y la cantidad de azúcares disponibles, es posible
manipular las características finales del producto fermentado, tal como el contenido de alcohol y
las propiedades sensoriales [29].
En cuanto a la caracterización microbiológica de la bebida fermentada, se obtuvo un nivel
muy inferior de Mohos y levaduras: 1E+4 UFC/mL demostrando que el consumo de la bebida
fermentada es seguro. Además, se registró un valor incontable de colonias en el petrifilm de ácido
lácticas: 3E+6 UFC/mL asegurando la presencia de bacterias lácticas en la bebida tradicional.
Estos resultados subrayan la importancia de las bacterias ácido-lácticas (BAL), no sólo por su
papel en la producción de metabolitos como el ácido láctico, sino también por su capacidad para
inhibir microorganismos patógenos, lo que contribuye tanto a la seguridad alimentaria como a la
estabilidad de los productos fermentados [30].
La bacteria seleccionada (colonia 1) fue identificada como una bacteria ácido-láctica mediante
pruebas bioquímicas y análisis microscópico, cumpliendo con las características descritas por
Khalid [31]. Los ensayos revelaron resultados negativos para catalasa y oxidasa, y se observó su
capacidad de crecer en un ambiente ácido, con un rango de pH entre 4 y 4,5. Las BAL presentaron
una morfología consistente, observándose cocos, cocobacilos y bacilos Gram positivos no
esporulados [32]. En un estudio de productos fermentados tradicionales ecuatorianos, incluída la
chicha, se aislaron 114 cepas bacterianas, predominando el género Lactobacillus (n=68), seguido
de Enterococcus (n=15), Pediococcus (n=13), Lactobacillus (n=10), Leuconostoc (n=7) y
Weissella (n=6). Es importante destacar que el género Leuc onostoc fue aislado principalmente de
bebidas fermentadas a base de maíz, yuca y chonta [33]. Con base en estos resultados, se concluye
que la bacteria aislada pertenece al grupo de BAL.
Las bacterias ácido-lácticas (BAL) son comúnmente empleadas para la producción de
bacteriocinas debido a su capacidad antimicrobiana, que permite inhibir o eliminar bacterias
patógenas de especies similares [34]. Esta propiedad es crucial en la industria alimentaria para
prevenir la degradación de alimentos por microorganismos patógenos, según lo indicado por [35],
[36]. Estudios recientes corroboran que las BAL no solo son productoras eficientes de
bacteriocinas, sino que también han demostrado su capacidad probiótica, lo que amplía su
aplicación en la industria alimentaria, al mejorar la salud del consumidor y la preservación de los
alimentos [29], [30].
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La actividad antimicrobiana (halos de inhibición) de la cepa bacteriana fue mayor en el
tratamiento Fructosa-peptona + 5 % + 72 horas para las tres bacterias patógenas (Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus y Lysinibacillus macroides), correlacionando con el crecimiento
bacteriano, que fue el más significativo. Investigaciones señalan que la producción de
bacteriocinas puede ser optimizada mediante la selección adecuada del sustrato y las condiciones
de fermentación, lo que permite un mayor control sobre la actividad antimicrobiana en la industria
alimentaria [29], [30].
Para las interacciones del factor A (Tipo de sustrato), B (Concentración del sustrato) y C
(Tiempo), en [37] la composición del medio de cultivo, como el tipo de sustrato y las
concentraciones de las fuentes de nitrógeno (Peptona) y carbono (Glucosa y Fructosa) tienen un
efecto clave en la producción de bacteriocinas. Investigaciones como la de Riley & Wertz [38]
también apoyan que la variación en la fuente de carbono puede influir drásticamente en la
capacidad de las BAL para sintetizar bacteriocinas, y esto coincide con la observación de que las
diferencias significativas en el pH corresponden a tratamientos con glucosa y fructosa.
Recientemente, se ha comprobado que las diferencias en la concentración de sustratos influyen
de manera directa no solo en la producción de bacteriocinas, sino también en la viabilidad de las
BAL durante la fermentación prolongada, lo que refuerza la necesidad de optimizar estas
condiciones para maximizar los beneficios industriales [30].
Existieron diferencias significativas en el pH, con menor pH se tiene a los tratamientos
Glucosa-peptona + 5 % + 72 horas (3,55) y Fructosa-peptona + 7 % + 72 horas (3,53), esto se
debe a que la cepa bacteriana prefiere fructosa en su mayor concentración, al término de 72 horas
aún sigue creciendo lo cual produce que su pH disminuye. Esto está en línea con investigaciones
recientes que demuestran que el crecimiento prolongado de LAB bajo condiciones ácidas
promueve la acidificación del medio debido a la acumulación de ácidos orgánicos [29]. Teniendo
una relación inversa entre la absorbancia y el pH. Esta relación inversa entre la absorbancia y el
pH es consistente con estudios como el de Papagianni [39], que exploran la relación entre la
disminución del pH y el crecimiento bacteriano en fermentaciones con bacterias ácido lácticas.
En cambio, se obtuvo un mayor valor de pH en el grupo Fructosa-Peptona + 0,5 % + 0 horas
(6,21) evidenciando que la bacteria prefiere un medio más suplementado, además este valor se
dio debido a que la bacteria aún estaba en un proceso de adaptación
.
Para la acidez, se observa diferencia significativa en los resultados, teniendo como mayor
producción al grupo Fructosa-peptona + 7 % + 72 horas (0,30), indicando que la bacteria produce
mayor acidez a través del tiempo, y que a mayor concentración del sustrato fructosa, se tendrá
mayor producción de acidez, hasta llegar a una etapa de muerte provocada por el estrés osmótico
autoacidificándose, reportado en estudios previos por [35], [40], [41], [42].
En cuanto a la absorbancia, se muestra diferencia significativa, teniendo en cuenta que la cepa
bacteriana creció más en el tratamiento Fructosa-peptona + 7 % + 72 horas (3,49), lo cual
demostró que el crecimiento bacteriano está correlacionado con la acidez. Sin embargo, el pH con
la absorbancia contiene una relación muy estrecha e inversamente proporcional. Este patrón ha
sido confirmado en investigaciones más recientes, que muestran cómo la disminución del pH
coincide con un aumento en la densidad celular, lo que refleja una mayor actividad metabólica de
las LAB en medios de fructosa [38], [39]. Los grados Brix concuerdan teniendo al tratamiento de
menor valor: Fructosa-peptona + 0,5 % + 72 horas (2,53 grados Brix), debido a que contiene la
menor concentración y que la bacteria consume los nutrientes en el mayor rango de tiempo
estudiado.
5. CONCLUSIONES
El tratamiento de fermentación con Fructosa-Peptona al 7 % durante 72 horas demostró ser el
más eficaz en términos de producción de bacteriocinas y eficiencia general del proceso
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fermentativo. Los parámetros cinéticos obtenidos bajo estas condiciones fueron pH de 3,53,
acidez de 0,30, absorbancia de 3,49 y grados Brix de 7,53, evidenciando una fermentación
eficiente con alta producción de bacteriocinas.
El crecimiento bacteriano, especialmente de las bacterias ácido lácticas (BAL), está
íntimamente relacionado con la composición del medio de cultivo, la concentración de sustrato,
el pH, y la producción de acidez. En nuestro estudio, se observó una correlación inversa entre el
pH y la absorbancia, indicando que la disminución del pH a medida que avanza la fermentación
está asociada con un aumento en la turbidez del medio, lo que refleja un crecimiento bacteriano
robusto. Asimismo, la correlación directa entre acidez y absorbancia sugiere que un mayor
crecimiento bacteriano está vinculado con una mayor producción de ácidos orgánicos.
La concentración de nitrógeno y carbono en el medio de cultivo juega un papel crucial en la
optimización del crecimiento bacteriano y la producción de bacteriocinas. En particular, la mayor
concentración de fructosa favorece una mayor producción de bacteriocinas y una mayor acidez,
destacando la importancia de ajustar las concentraciones de sustrato para maximizar los
beneficios del proceso fermentativo.
Sin embargo, es importante señalar que en este estudio no se evaluaron factores adicionales
como la temperatura y la presencia de inhibidores, los cuales podrían haber influido en la
fermentación y en la producción de bacteriocinas. La temperatura puede afectar
significativamente la actividad metabólica de las BAL, y la presencia de inhibidores puede alterar
la eficiencia del proceso fermentativo y la producción de bacteriocinas. En investigaciones
futuras, se recomienda incluir estos factores para obtener una comprensión más completa del
proceso de fermentación y de las condiciones óptimas para la producción de bacteriocinas.
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Copyright (2025) © Serpa Evelyn Marlein, Viteri Brandon Fernando, Sungey Sánchez Llaguno y Juan Neira Mosquera.
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