InGenio Journal
Revista de Ciencias de la Ingeniería de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo
https://revistas.uteq.edu.ec/index.php/ingenio
e-ISSN: 2697-3642 CC BY-NC-SA 4.0
Volumen 5 | Número 1 | Pp. 65–70 | Enero 2022 Recibido (Received): 2021/08/03
DOI: https://doi.org/10.18779/ingenio.v5i1.477 Aceptado (Accepted): 2021/12/16
Aislamiento e identificación molecular de Salmonella
spp., a partir de muestras de agua de consumo humano
(Isolation and Molecular Identification of Salmonella Spp., from Water
Samples for Human Consumption)
Favian Bayas-Morejón*, Sonia Salazar-Ramos, Katherin Beltrán, Luis Verdezoto
Centro de Investigación y Desarrollo Biotecnológico, Departamento de Investigación y Vinculación,
Universidad Estatal de Bolívar, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Recursos Naturales y del Ambiente,
Guaranda 020150, Ecuador
fbayas@ueb.edu.ec, ssalazar@ueb.edu.ec, kbeltran@ueb.edu.ec, lverdezoto@ueb.edu.ec
Resumen: El objetivo del estudio fue evaluar la ocurrencia de Salmonella spp. en 100
muestras de agua, recolectadas de cinco áreas de la ciudad de San José de Chimbo, prov.
Bolívar. Todas las muestras de agua fueron filtradas mediante el uso de una rampa de succión
y filtros de membrana y luego cultivadas utilizando métodos específicos para el género de
interés y los aislados obtenidos fueron confirmados mediante microscopia y PCR (Reacción
en Cadena de la Polimerasa). Tras los análisis, se detectó el patógenos en el 10% de las
muestras de agua analizadas. El mayor número de muestras contaminantes se encontró en las
fuentes de consumo directo, a diferencia de las muestras obtenidas directamente del talud que
no parecían estar contaminadas.
Palabras clave: Salmonella spp, caracterización, agua potable.
Abstract: The objective of the study was to evaluate the occurrence of Salmonella spp. in
100 water samples, collected from five areas of the city of San José de Chimbo, prov. Bolivar.
All the water samples were filtered using a suction ramp and membrane filters and then
cultured using specific methods for the genus of interest and the isolates obtained were
confirmed by microscopy and PCR (Polymerase Chain Reaction). After analyzes the
pathogens were detected in 10% of the analyzed water samples. The highest number of
contaminating samples was found in the sources of direct consumption, unlike the samples
obtained directly from the slope that did not appear to be contaminated.
Keywords: Salmonella spp., characterization, drinking water.
1. INTRODUCCIÓN
Mientras que los países en desarrollo continúan luchando con el tema de la inocuidad de los
alimentos, es decir, la cantidad de alimentos suficiente para el consumo de la población en
crecimiento; Existe otro dilema en estos países, se estima que más de 200 tipos de enfermedades
producidas por patógenos son de transmisión alimentaria, causando problemas en grupos
vulnerables, por lo que garantizar una alimentación saludable es un desafío para la salud pública
[1]. Entre estos patógenos se encuentra el género Salmonella spp. [2]. Durante los últimos años,
Salmonella spp. Ha venido siendo uno de los agentes causales más importantes de enfermedades
transmitidas por alimentos en países desarrollados y en vías de desarrollo y es una de las
principales causas de enteritis bacteriana aguda en personas en todo el mundo, además, se asocia
comúnmente con ganado y aves de corral [3]. Para la identificación de las especies de Salmonella
se han desarrollado métodos de identificación más rápidos y con mayor especificidad que los
InGenio Journal, 5(1), 65–70
| 66
convencionales, entre los que se encuentran la PCR y la PCR Multiplex [4]. El presente estudio
fue diseñado con el objetivo de conocer la ocurrencia de Salmonella en agua mediante métodos
de cultivo y moleculares.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Colección de muestra
El presente estudio fue descriptivo, experimental, transversal, realizado durante los meses de
marzo a octubre de 2018, donde se determinó la presencia de Salmonella en 100 muestras de
aguas para consumo humano en cinco áreas o localidades de la ciudad de San José de Chimbo,
Ecuador (Tabla 1). Todas las muestras fueron transportadas y analizadas en un periodo no mayor
a 4 horas partiendo desde el momento de la toma, Los análisis fueron realizados en el laboratorio
de Microbiología de la Universidad Estatal de Bolívar.
Tabla 1. Áreas de muestreo de agua
Área
Área de muestreo de agua
Nº de muestras
1
Restaurantes
15
2
Centros educativos
25
3
Viviendas privadas
18
4
Lugares públicos
32
5
Vertientes principales y secundarias
10
Total
100
2.2. Técnica y proceso para la recolección de muestras
Las muestras de agua se recolectaron en recipientes plásticos previamente esterilizados, se
utilizaron dos recipientes para cada punto de muestreo. La recolección se realizó directamente de
los grifos de abastecimiento de agua de los puntos mencionados, utilizando los parámetros
descritos en las Normas INEN 1998.
2.3. Preparación de la muestra y cultivo inicial
Se tomaron 100 mL de agua potable recolectada y se filtraron en una rampa de succión usando
filtros de membrana (CHM, MPV045047H, España), luego de la succión completa, se retiró
cuidadosamente el papel de filtro y se colocó en placas de agar Rappaport (OXOID, CM0669,
OK) específico para el crecimiento de enterobacterias. Se dejó incubar a 37°C durante 24 horas.
Las colonias consideradas sospechosas se cultivaron en agar XLD (OXOID, CM0469, Reino
Unido) bajo las mismas condiciones.
2.4. Confirmación microscópica
Las colonias con crecimiento considerable se analizaron mediante tinción de Gram. La
identificación característica de Salmonella por tinción es un bacilo Gram negativo.
InGenio Journal, 5(1), 65–70
| 67
2.5. Análisis molecular
Cinco colonias de cada cepa cultivadas en agar TBX se suspendieron en 500 µL de tampón
TAE 1X y se centrifugaron a 16.000 g durante 10 min a temperatura ambiente. La extracción de
ADN se realizó utilizando el kit de purificación de ADN PureLink ™ Microbiome (Invitrogen,
EE. UU.) Siguiendo las instrucciones del fabricante.
2.6. Ensayo de PCR y electroforesis
La PCR se realizó según el método establecido por Cheng et al. [5]. Para la electroforesis, 5μL
de productos de amplificación fueron mezclados con 2 μL de tampón de carga Blue/Orange 6X,
charge dye (Promega, EE. UU) en geles de agarosa al 1,5% preparados con tampón TAE con 2
μL de SYBR Safe DNA (Invitrogen, EE. UU.), Luego el gel fue expuesto a 100 V durante 40
min. Finalmente, los tamaños de las bandas se visualizaron con un transiluminador UV. Como
controles positivos se utilizó ADN de la cepa de referencia Salmonella arizonae (ATCC 13314).
Los aislados de Salmonella spp. se almacenaron en crioviales (Microbank ™ Prolab Diagnostics,
EE. UU) a -80 °C.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis microbiológico El aislamiento cultural de Salmonella mostró que 10 muestras de un
total de 100 muestras tenían presencia de patógeno, con un total de 10 aislamientos (Tabla 2). Las
colonias sospechosas mostraron un color típico de blanco a gris blanquecino, Gram negativas
después de la tinción.
Tabla 2. Muestras detectadas con Salmonella mediante cultivo.
N de muestra
N muestras positivas por
cultivo (%)
15
3 (20)
25
3 (12)
18
2 (11,1)
32
2 (6,25)
10
0 (00)
100
10
Luego del análisis, la mayor prevalencia de Salmonella se obtuvo en muestras de restaurantes
con valores del 20% cada una, seguida de muestras obtenidas de escuelas y domicilios particulares
con valores superiores al 10%, finalmente, la menor prevalencia con valores menores al 10% se
detectó en lugares públicos, en las vertientes no se detectó contaminación.
Esto demuestra que la contaminación se da en el trasvase de agua, además, a pesar de que el
tratamiento del agua de Salmonella se ha detectado en el agua de consumo final, esto
probablemente se deba a que este patógeno puede sobrevivir en ambientes acuáticos a través de
varios mecanismos, entre ellos entrar en el estado viable pero no cultivable (VBNC) y / o residir
dentro de protozoos de vida libre [6]. Kovačić y col. [7], informó un brote de salmonelosis en
InGenio Journal, 5(1), 65–70
| 68
Šibenik, Croacia, que ocurrió en septiembre de 2014, el análisis microbiológico reveló que el
brote fue causado por Salmonella enterica subsp. Enteritidis serovar entérico y se realizó con el
agua subterránea de un manantial local. En otro estudio, Ekelozie et al. [8]. analizaron 220
muestras de agua en el estado de Anambra Nigeria, donde Salmonella fue más prevalente en el
35.0% de las muestras de agua del embalse examinadas, S. typhi fue la especie más prevalente,
este resultado fue superior al obtenido en nuestro estudio. Además, Karkey et al. [9], detectaron
ADN de S. typhi y S. paratyphi en 333 (77%) y 303 (70%) de 432 muestras de agua analizadas
respectivamente, además, los autores descubrieron que la lluvia es un factor clave en esta
contaminación fecal, que se correlaciona con los nitratos. Hernández-Domínguez et al. [10],
donde de un total de 71 muestras de agua analizadas, solo el 4% fueron positivas para Salmonella
spp. que se detectaron principalmente en muestras de agua no clorada.
3.1. Identificación de los aislados de Salmonella spp. por PCR
En la PCR para la detección de Salmonella spp, todos los aislados caracterizados previamente
por cultivo y tinción de Gram mostraron la amplificación a una altura de banda característica de
262-pb (Figura 1), demostrando que los aislados obtenidos fueron positivos a pertenecer al género
Salmonella, en un 10%, Un resultado parecido al nuestro fue informado por Shankar et al. [11],
donde los investigadores analizaron mediante PCR 158 muestras de agua potable, obteniendo un
valor de 17,72%. En otro trabajo desarrollado en Irán por Bonyadian et al. [12], de 240 muestras
de agua embotellada, los resultaros revelaron el gen IpaB de Salmonella sp con un 0,4%de las
muestras positivas.
Figura 1. Electroforesis de la PCR convencional para la identificacaiòn de Salmonella spp. in
muestras de agua de consumo humano: Carril M: Marcador de pesos moleculares, 100 pb,
carriles 1-10: Salmonella spp.
4. CONCLUSIONES
Los niveles de detección de Salmonella son preocupantes considerando que la normativa exige
la ausencia de patógenos en el agua para que pueda ser considerada apta para el consumo humano,
lo que lleva a decisiones serias para evitar problemas de salud a la población.
InGenio Journal, 5(1), 65–70
| 69
AGRADECIMIENTOS: Este estudio fue apoyado por el Proyecto PIV-30-2018, del
Departamento de Investigación y Vinculación, Universidad Estatal de Bolívar, Ecuador; Además,
gracias también al proyecto de canje de deuda Ecuador-España por haber proporcionado los
equipos utilizados en este estudio.
REFERENCIAS
[1] N. Paudyal, V. Anihouvi, J. Hounhouigan, M.I. Matsheka, B. Sekwati-Monang, W. Amoa-
Awua, A. Atter, N. Ackah, S. Mbugua, A. Asagbra, W. Abdelgadir, J. Nakavuma, M.
Jakobsen y W. Fan, “Prevalence of foodborne pathogens in food from selected African
countries a meta-analysis”. International Journal of Food Microbiology, 249, pp. 35–43,
2017.
[2] F. Bayas-Morejón, A. Tigre, I. Aldaz, P. Parra, E. Ramos, R. Remache y C. Zamora,
“Incidence of Salmonella spp. in Different Animal Species and Meat Products in Ecuador
During the Period 2009-2019”, J Pure Appl Microbiol, vol. 13, no. 2, pp. 725-732, 2019.
doi: 10.22207/JPAM.13.2.08
[3] L.A. Andoh, S. Ahmed, J.E. Olsen, et al., “Prevalence and characterization of Salmonella
among humans in Ghana”, Trop Med Health, vol. 45, no. 3, 2017.
https://doi.org/10.1186/s41182-017-0043-z.
[4] R.L.Lindsey, L. Garcia-Toledo, D. Fasulo, L.M. Gladney, y N. Strockbine, “Multiplex
polymerase chain reaction for identification of Escherichia coli, Escherichia albertii and
Escherichia fergusonii”, J. Microbiol. Methods, 140, pp. 1–4, 2017.
[5] C.M. Cheng, W. Lin, K.T. Van, L. Phan, N.N. Tran, y D., Farmer, “Rapid detection of
Salmonella in foods using real-time PCR”, J Food Prot., vol. 71, no. 12, pp. 2436‐2441,
2008. doi:10.4315/0362-028x-71.12.2436
[6] H. Liu, C. Whitehouse, y B. Li, “Presence and Persistence of Salmonella in Water: The
Impact on Microbial Quality of Water and Food Safety”, Front Public Health, vol. 6, no.
159, 2018. doi: 10.3389/fpubh.2018.00159.
[7] A. Kovačić, Z. Huljev, E. Sušić, “Ground water as the source of an outbreak of Salmonella
Enteritidis”, Journal of Epidemiology and Global Health, vol. 7, no. 3, pp. 181-184, 2017.
[8] IS. Ekelozie, I. Ekejindu, O. Ochiabuto, M. Obi, U. Onwuasonya, y E., Obeagu, “Evaluation
of Salmonella Species in Water Sources in Two Local Government Areas of Anambra State”,
Cohesive J. Microbiol infect Dis, vol. 1, no. 1, CJMI.000501, 2018. DOI:
10.31031/CJMI.2018.01.000501.
[9] A. Karkey, T. Jombart, A. Walker, C. Thompson, A. Torres, S. Dongol, N. Vu Thieu, D.
Thanh, D. Thi Ngoc, P. Vinh, A. Singer, J. Parkhill, G. Thwaites, B. Basnyat, N. Ferguson,
y S. Baker, “The Ecological Dynamics of Fecal Contamination and Salmonella Typhi and
Salmonella Paratyphi A in Municipal Kathmandu Drinking Water”, PLoS Negl Trop Dis,
vol. 10, no. 1, 2016. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004346.
[10] C. Hernández-Domínguez, AM. Hernández-Anguiano, C. Cháidez-Quiroz, G. Rendón-
Sánchez y T. Suslow, “Detección de Salmonella y coliformes fecales en agua de uso agrícola
para la producción de melón "Cantaloupe"”, Agricultura técnica en México, vol. 34, no. 1,
pp. 75-84, 2008. https://doi.org/10.1016/j.jegh.2017.05.001
[11] P. Shankar, J. Mishra, V. Bharti, D. Parashar, y S. Singh, “Multiplex PCR
assay for simultaneous detection and differentiation of Entamoeba histolytica, Giardia
InGenio Journal, 5(1), 65–70
| 70
lamblia, and Salmonella spp. in the municipality-supplied drinking
water”, J Lab Physicians, vol. 11, pp. 275-80, 2019.
[12] M. Bonyadian, H. Moshtaghi, y H. Nadi, “PCR detection of Vibrio cholerae, Escherichia
coli, and Salmonella sp. from bottled drinking water in Iran”, J Infect Dev Ctries, vol. 12,
no. 9, pp. 700-705, 2018. doi: 10.3855/jidc.10160. PMID: 31999626.