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Recibido: 6/09/2022. Aceptado: 30/11/2022
Publicado el 27 de diciembre de 2022
Cienc Tecn UTEQ (2022) 15(2) p 43-52 ISSN 1390-4051; e-ISSN 1390-4043
Análisis logenético de aislamientos patogénicos de la familia Botryosphaeriaceae en cacao
(Theobroma cacao L.) en la zona de Los Ríos
Phylogenetic analysis of pathogenic isolates of the Botryosphaeriaceae family in cacao (Theobroma cacao L.) in the Los
Ríos area
Wendy Jiménez
1
, Andrés Ramírez
2
, Jonathan López
1,2
, Andry Alvarez
3
1
Instituto Superior Tecnológico Ciudad de Valencia, Quevedo, Los Ríos, Ecuador, wendyjimenez@itscv.edu.ec.
2
Universidad
Técnica de Cotopaxi-(UTC), La Maná, Cotopaxi, Ecuador, andrefer67@hotmail.com, jonth.lopz@gmail.com.
3
Egresada de la
Universidad de Córdoba, Córdoba, España, andryalvarezaspiazu@gmail.com.
Correspondencia para autor: wendyjimenez@itscv.edu.ec.
Ciencias Agrarias / Agricultural Sciences
Resumen
L
os problemas tosanitarios causados por hongos
vasculares que afectan a las plantaciones de cacao CCN-
51, han tomado gran importancia en las últimas décadas,
por los daños que le producen. Especies de la familia
Botryosphaeriaceae están asociadas a cancros y secamiento de
yemas, muerte descendente, pudrición de frutos y pudrición
del cuello, síntomas que se han observados en diferentes zonas
y que merman la producción de la planta. Con el objetivo
de caracterizar e identicar a nivel molecular aislamientos
patogénicos de este hongo, se muestrearon cinco árboles
sintomáticos seleccionados de ncas localizadas los cantones:
Buena Fe, Mocache, Quevedo, Quinsaloma y Valencia de la
provincia de Los Ríos, obteniendo 15 aislamientos de los cuales
se extrajo ADN y utilizaron secuencias de las regiones de ITS
(Internal transcribed spacer) y EF1-α (Factor de elongación
de alpha). Los tamaños de secuencia se vericaron mediante
electroforesis y se establecieron las identidades putativas de
3 especies utilizando la herramienta de Basic local aligment
(BLAST). Los árboles logenéticos construidos mediante los
algoritmos de máxima verosimilitud y vecinos cercanos, con
los aislamientos en cinco cantones, conrmaron la presencia
de Lasiodiplodia theobromae en Quevedo, Diplodia seriata en
Quinsaloma y Botryosphaeria dothidea en Valencia, Mocache
y Buena Fe, resaltando una politomía entre estos últimos.
Palabras claves: Cancro, cacao, Región ITS, EF1-a, logenia
Abstract
P
hytosanitary problems caused by vascular fungi aecting
CCN-51 cocoa plantations have become very important
in recent decades, due to the damage they cause. Species of
the Botryosphaeriaceae family are associated with cankers
and drying of buds, downward death, fruit rot and neck rot,
symptoms that have been observed in dierent areas and that
reduce plant production. In order to characterize and identify
pathogenic isolates of this fungus at the molecular level, ve
symptomatic trees were sampled from farms located in the
cantons of: Buena Fe, Mocache, Quevedo, Quinsaloma and
Valencia of the province of Los Rios, obtaining 15 isolates
from which DNA was extracted and sequences from the ITS
(Internal transcribed spacer) and EF1-α (Elongation factor
of alpha) regions were used. Sequence sizes were veried
by electrophoresis and putative identities of 3 species were
established using the Basic local aligment tool (BLAST).
Phylogenetic trees constructed using maximum likelihood
and nearest neighbor algorithms, with isolates in ve cantons,
conrmed the presence of Lasiodiplodia theobromae in
Quevedo, Diplodia seriata in Quinsaloma and Botryosphaeria
dothidea in Valencia, Mocache and Buena Fe, highlighting a
polytomy among the latter.
Key words: Cancro, cacao, ITS Region, EF1-a, philogene.
https://doi.org/10.18779/cyt.v15i2.583
Jiménez et al., 2022
Ciencia y Tecnología. 2022. 15(2):43-5244
Introducción
Dentro de los cultivos de mayor importancia en
Ecuador, se encuentra el cacao (Theobroma cacao L.), una
fruta tropical mayormente producida en las provincias de
Manabí, Sucumbíos, Guayas y Los Ríos (Guerrero, 2015).
La producción de cacao no o de aroma es de 173000 t
aproximadamente, los cuales provienen de 17 países de los
que destaca el Ecuador con una producción del 61% (Pino,
2010), el cual además se posiciona como el primero en cuanto
a calidad.
No obstante, en los últimos años, una de las limitantes
que han puesto en riesgo su producción es la presencia
de enfermedades originadas por hongos de la familia
Botryosphaeriaceae, siendo el más representativo Lasiodiplodia
theobromae, el cual provoca la muerte descendente de ramas
y pudrición de frutos (Picos et al., 2015), causando pérdidas
severas después de la cosecha y aún más importantes durante
el almacenamiento prolongado, reduciendo la calidad de los
frutos y limitando su comercialización (Sandoval et al., 2013).
En cacao se han reportado síntomas asociados a
Lasiodiplodia en Filipinas en el año 2014 (Alvindia &
Gallema, 2017). A pesar de existir investigaciones que
indicarían la presencia de Lasiodiplodia en plantaciones de
cacao desde 1890 en Ecuador (Crous et al., 2006), no se han
realizado estudios que permitan conrmar el agente causal a
nivel molecular. En relación a aquello, se han determinado
correlaciones logenéticas de esta especie y genero crípticas
a través del análisis de ADN en fragmentos de las regiones
espaciadoras intergénicas (ITS), la beta-tubulina BT2a y
BT2b y el factor de elongación 1 alfa (EF-1α), accediendo
ubicaciones más precisas en concordancia a especímenes
análogos o contiguamente relacionados, de la misma manera,
Picos et al. (2015), reportan la especie L. theobromae, como
la causante de cancros y la separan de Dothidea Theobromae,
pese a su similar sintomatología.
En ese contexto, esta investigación tuvo como objeto
analizar la diversidad genética de la familia Botryosphaeriaceae
presente en cacao en la zona de Los Ríos mediante un árbol
logenético de las secuencias de ITS y EF1-alpha.
Materiales y métodos
Esta investigación contó con una fase en campo y otra en
laboratorio. Considerando los sitios de origen de las muestras
recolectadas, la fase de campo consistió en colectar material
vegetal de la variedad CCN 51 en ncas de los cantones:
Buena Fe, Mocache, Quevedo, Quinsaloma y Valencia de la
provincia de Los Ríos. Se muestrearon tallos con síntomas
de enfermedades topatológicas y en la fase de laboratorio
se realizaron los aislamientos, identicación, extracción de
ADN, secuenciación y análisis.
Recolección de muestras en campo
El muestreo se realizó en ncas cacaoteras previamente
identicadas con plantas con síntomas. Usando el método
por conglomerados con georreferenciación de las zonas
muestreadas, se procedió a seleccionar por cada cantón de
la provincia de Los Ríos, Ecuador (Figura 1), tres zonas, y
por cada zona tres plantas de cacao con síntomas de muerte
regresiva en el tallo, de los cuales se extrajo una porción en el
sitio de intersección entre el desarrollo del hongo y la porción
sana. Cada muestra obtenida fue debidamente etiquetada y
conservada en refrigeración hasta su ingreso al laboratorio.
Figura 1. Zonas muestreadas en los cantones de la
provincia de Los Ríos, Ecuador
Siembra de aislamientos en laboratorio
Cada muestra fue tratada mediante el método descrito
por Wright y Harmon (2010) para obtener los aislamientos
de Botryosphaeriaceae, a los cuales se les esterilizó la
supercie exterior del tejido y se procedieron con la interface
de infección en medio de cultivo de la siguiente manera: Se
realizaron cortes a partir de trozos de ramas de 10 x 10 mm
obtenidos desde las zonas de avance de infección, los cuales
se desinfectaron etanol al 70% durante 30 segundos, seguido
por hipoclorito de sodio al 5% durante 3 minutos y varios
lavados. Para secarlos se usó papel absorbente y después
fueron dispuestos en placas de Petri conteniendo medio papa
dextrosa agar PDA. Todas las placas se mantuvieron a una
temperatura de 24ºC por tres semanas (Suarez, 2016).
Los hongos con la morfología y características de los conidios
consistentes con Botryosphaeriaceae (Mehl et al., 2017)
fueron aislados a partir de una punta de hifa en cajas Petri con
medio papa dextrosa agar PDA.
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Identicación morfológica
Con la nalidad de comprobar que los aislamientos
correspondan a la familia Botryosphareceae, se procedió
a la identicación morfológica en su estado asexual,
considerando que una denición completa de la familia en la
que consideraban que las ascosporas eran hialinas y aseptado,
y que podrían pigmentarse y tabicarse con la edad. Es más,
una circunscripción basada únicamente en el estado sexual
no es adecuada especialmente porque algunas especies se
conocen sólo por su estado asexual, mientras que en otros
el estado sexual es extremadamente infrecuente. Dado estas
condiciones se proporciona una circunscripción modicada de
la familia, dicha información fue corroborada por Slippers y
Wingeld (2007) citado por Phillips et al. (2013), quienes se
basaron en la morfología asexual, dado que la sexual no se
conoce para algunos géneros, es muy poco común para otros y
no se ha inducido en cultivo. Además, las conidias producidas
fueron examinados en microscopio óptico y se utilizaron las
claves de Barnett y Hunter (2010) y Walker (1980), para la
identicación a nivel de género.
Caracterización molecular
Extracción de ADN
Los aislamientos fúngicos fueron caracterizados
molecularmente de acuerdo con los pasos de la Figura 2. A las
quince cepas seleccionadas se les extrajo el ADN utilizando
un kit de extracción DNA easy Plant mini Kit (Qiagen,
Valencia, CA, USA) siguiendo las indicaciones del fabricante.
Usando los buers presentes en el kit, en el siguiente orden:
1. Buer de lisis junto con el micelio del hongo. 2. Buer
AW1 y AW2 que permitieron lavar y ltrar por medio de la
membrana de sílice el ADN puro sin la presencia de proteínas
u otros elementos.3. Buer AE, para asegurar la obtención del
ADN puro.
Figura 2. Diagrama sobre la metodología empleada para
la caracterización molecular de aislamientos patogénicos
de la familia botryosphaeriaceae en cacao (Theobroma
cacao L.) en la zona de Los Ríos
La concentración y calidad de ADN se vericó
visualizándolo en un gel de agarosa 2% luego de la
electroforesis. El ADN ribosomal con las secuencias de
los espaciadores transcritos internos (ITS) y el factor de
elongación 1-alpha se amplicaron usando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y la combinación de los
iniciadores universales ITS1 e ITS4 (White et al., 1990) y
EF1-728F y EF1-986R (Carbone & Kohn, 2014) como se
muestra en el Cuadro 1.
Cuadro 1. Descripción de las secuencias de los cebadores
para los genes ITS y EF-a
Los pasos a seguir en la PCR fueron los siguientes:
1. Por 30 segundos, se realizó una desnaturalización inicial
a 98°C.
2. Durante 10 segundos una desnaturalización de 98°C.
3. Durante 10 segundos una hibridación de los cebadores
a temperatura de 52°C, y durante 23 segundos una
temperatura de extensión de 72°C.
Los últimos tres pasos se repitieron 35 ciclos, para
culminar con una temperatura de extensión nal de 72°C
durante 5 minutos (Guamán, 2018)
El producto de la PCR fue visualizado en un gel de
agarosa siguiendo la metodología usada por Silva (2018) y
puricado usando el kit (QUIAGEN) de puricación. Para
concluir, el producto nal fue enviado para su secuenciación
a PROMEGA. Con las secuencias obtenidas se creó un árbol
logenético de las cepas aisladas en Ecuador.
Diseño de la investigación
Análisis estadístico
La estadística usada para el análisis de las secuencias
genéticas fue inferencial, usando los programas informáticos
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) y MEGA
(Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (versión 6.0), para
el método de unión de vecinos (neighbor joining) y máxima
verosimilidad (máximum-likelihood). Este último, emplea
modelos probabilísticos para seleccionar el mejor árbol, es
decir aquel que tenga la probabilidad más alta (verosimilitud)
de reejar el proceso real evolutivo (Rodríguez, 2013).
Análisis logenético
Teniendo como base la metodología usada por Caicedo
et al. (2017) se realizó el análisis logenético, así, los
resultados de las secuencias obtenidas de las muestras de ADN
que se encontraban en forward y reverse, fueron unidas y
alineadas con el programa MEGA-X, cada secuencia nal fue
comparada con la herramienta BLASTn de la plataforma del
Gen Cebador Secuencia (5´-3´) Referencia de
publicación
ITS ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
White et al. (1990)
EF-a EF1-728F CAT CGA GAA GTT CGA GAA GG
EF1-986R TAC TTG AAG GAA CCC TTA CC
White et al. (1990)
Jiménez et al., 2022
Ciencia y Tecnología. 2022. 15(2):43-5246
NCBI
(
National Center for Biotechnology Information )
, para
encontrar la secuencia con mayor similitud de una especie ya
reportada en la base de datos.
Para los genes ITS y EF-alpha, en un bloc de notas
se ingresaron las secuencias de la investigación junto con
secuencias de referencia, basadas en el estudio de Phillips
et al. (2013) mismas que fueron obtenidas del Gen Bank
con programa BLAST. Se utilizó la función MUSCLE del
Programa MEGA-X, para la alineación múltiple de las
secuencias, y para su análisis comparativo se empleó el
algoritmo ML y N, generando así árboles logenéticos. Para la
comparación con especies reportadas en la familia se utilizaron
secuencias de referencia identicadas en investigaciones
previas, descartando los taxones más antiguos y enfocándose
en los géneros que pueden ser reconocidos logenéticamente
y las especies de Botryosphaeriaceae, que se conocen
actualmente por cultivo. A continuación, En el Cuadro 2 se
presentan los números de accesiones que se consideraron para
la elaboración de los mapas.
Se evaluó la variación genética de las regiones espaciadoras
intergénicas (ITS), y la variación genética del Factor de
elongación 1 alfa (EF-1α) de los diferentes aislamientos de
la provincia
Resultados y discusión
Caracterización morfológica de los aislamientos.
Los quince aislamientos, correspondientes al 100%,
desarrollaron un crecimiento circular de coloración
blanquecina al inicio, que con el paso de los días se tornó
oscura, en medio PDA, independiente de su especie y
localidad, como lo muestra la Figura 3.
Figura 3. Vista frontal (A)- Crecimiento del patógeno a
los 15 días, colonia cultivada en medio PDA a partir de
una porción de tallo. Vista Posterior (B)-La coloración
oscura que se observa a los 15 días está relacionada a los
compuestos secretados por el hongo al medio PDA.
Los análisis morfológicos realizados a los aislamientos
antes mencionados, corroboraron que son hongos
pertenecientes a la familia Botryosphaeriaceae, de acuerdo a
imágenes de referencia. Las guras a continuación, muestran
sus estructuras observadas a través del microscopio:
Descripción de conidias.
Las conidias de los aislamientos de todos los cantones,
demostraron ser de pared estrecha, delgada, estriados y con
un tabique, pudiendo ser ahusado o no en sus extremos.
Los resultados morfológicos expuestos, concuerdan con los
obtenidos por Phillips et al. (2013), quienes maniestan que
dentro de la familia Botryosphaeriaceae, se pueden encontrar
conidios con extremos ahusados en uno o varios extremos, con
paredes delgadas o gruesas. Pudiendo ingresar directamente
mediante aberturas en las plantas sanas sean estas lenticelas
u estomas (E. A & F. F, 1981) (KiWoo et al., 1999). Estudios
moleculares realizados por Santiago et al. (2015), al género
Botryosphaeria, mostraron poca variabilidad genética entre
sí, agrupando a todos como los causantes de secamiento de
plantas de diversas especies.
BA
Cuadro 2. Especies tipo de la familia Botryosphareceae, con sus respectivos códigos de genbank (Phillips et al., 2013)
Número de acceso a Genbank
ESPECIES ITS EF1a
Barriopsis fusca EU673330 EU673296
Botryobambusa fusicoccum JX646792 JX646857
Botryosphaeria dothidea AY236949 AY236898
Cophinforma atrovirens JX646800 JX646865
Diplodia mutila AY259093 AY573219
Diplodia seriata AY259094 AY573220
Dothiorella sarmentorum AY573212 AY573235
Endomelanconiopsis endophytica EU683656 EU683637
Lasiodiplodia theobromae AY640255 AY640258
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Figura 4. Conidiosporas de aislamientos de ncas del cantón Quevedo (A), Quinsaloma (B), Valencia (C), Buena Fe (D),
Mocache (E).
Caracterización molecular
El tamaño de los amplicones en todos los aislamientos
de Botryosphareceae, para cada gen taxonómico, fue igual,
siendo estos de 520 pb para ITS (gura 5) y 450 pb para
EF1-a (Figura 6), el producto de la PCR fue observado en el
gel de agarosa. La intensidad del color que muestra el gel, se
debe a la cantidad de ADN existente, de aquí la colorimetría
de la Figura 6. Es importante mencionar que el kit de
extracción presenta una medida estándar de extracción, es
decir que la cantidad analizada en cada muestra es la misma.
Figura 5. Visualización en gel de agarosa al 2% de
productos de PCR con los marcadores ITS1 e ITS 4 para
amplicar parte de las regiones ITS
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 2%, del
producto PCR para el factor de elongación Alpha de los
distintos aislados
Continuando con la caracterización molecular, el número
de pares de bases obtenidos para el gen ITS y EF1-a, son
semejantes a los reportados en Marques et al. (2013) quienes
encontraron 600 pb para la región ITS y 650 para EF1-a. Los
resultados brindados por el BLAST, permitieron corroborar
el parecido existente entre los aislamientos de la provincia
de Los Ríos y las especies reportadas en otros países,
como la causante de muerte y cancros en diferentes plantas
forestales y frutales pese a la escasa investigación. Tal es el
caso de Chile, donde existe mayor cantidad de información
reportada de daños en especies frutales, ocasionada por
Botryosphaeriaceae. Así por ejemplo, se han identicado
Diplodia seriata, B. dothidea (encontrados también en esta
investigación), D. mutila, y Spencermartinsia viticola como
los responsables de muerte regresiva, en viñedos (Chou,
1988). Otro estudio en mango realizado por Sandoval et al.
(2013) demostró que la sintomatología se presentaba en ramas
con secamiento descendente que mostraban haces vasculares
Jiménez et al., 2022
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Análisis logenético
El árbol logenético para los genes ITS y EF1-a, construido con los algoritmos de máxima verosimilitud y vecinos cercanos se
muestran en las guras 7, 8, 9 y 10.
Figura 7. Modelo de máxima verosimilitud con las regiones ITS construido mediante Inferencia Bayesiana de 15
aislamientos del complejo Botryosphareceae. Los recuadros muestran el código genbank de la accesión tipo a la que más
se asemejan. La cantidad de cambios esperados por sitio es indicada por la barra de escala.
necrosados y exudados gomosos rojizos, los cuales exhibían
secamiento con defoliación parcial y ramas con hojas secas y
verdes, fueron atribuidos a Lasiodiplodia theobromae.
Análisis Blast (Basic Local Alignment Search Tool)
Con las secuencias obtenidas forward y reverse,
previamente alineadas, se procedió a la identicación
mediante la herramienta básica de búsqueda de alineación
local. La Cuadro 3 se muestra la identicación realizada en
el BLAST de acuerdo con los aislamientos, en la columna
especie se muestra la que más se asemejó con su respectivo
porcentaje de identidad. Además, en la última columna se
encuentra el código GenBank correspondiente a cada especie.
Cuadro 3. Especies del genbak más parecidas a los aislamientos de la investigación
Gen Aislamiento Especie Cubierta de
consulta (%)
Identidad (%) Código GenBank
Q1
Lasiodiplodia theobromae
100 100 MT644474
QUIN1
Diplodia seriata
100 100 MN634025
ITS VAL 1
Botryosphaeria dothidea
100 100 MK178545
BF1
Botryosphaeria dothidea
100 100 MN634016
M1
Botryosphaeria dothidea
100 100 MT252674
Q1
Diplodia seriata
100 99.77 FJ904868
QUIN1
Diplodia seriata
100 99.64 MK759849
EF-a VAL 1
Botryosphaeria dothidea
100 100 MT454342
BF1
Botryosphaeria dothidea
100 100 KP721654
M1
Botryosphaeria dothidea
100 100 KP721653
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El modelo de Tamura-Nei junto con el método de máxima
verosimilitud, permitieron inferir la historia evolutiva y el árbol
mostrado posee la mayor probabilidad logarítmica. Después
de aplicar los algoritmos NJ y BioNJ a la matriz de distancias
por pares. El árbol dibujado a escala, muestra las longitudes
de las ramas medidas en el número de sustituciones por sitio.
Involucrando 14 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de
codón incluidas fueron 1ª + 2ª + 3ª + Sin codicación. Con un
total de 599 posiciones en la database nal.
Para el caso del aislamiento BF1, M1 y VAL1 se
establece una politomía, que no permite establecer un orden
de ramicación, pero relacionándolos con Botryosphaeria
dothidea. Por otro lado, los árboles logenéticos observados,
muestran la misma topología para cada región, y se diferencian
claramente tres especies.
Figura 8. Árbol logenético derivado de la secuencia de las regiones ITS con el modelo de vecinos cercanos. Los recuadros
muestran el código Genbank de la accesión tipo a la cual más se parecen.
La historia evolutiva se inrió mediante el método de
unión de vecinos. Se muestra el árbol óptimo con la suma
de la longitud de la rama = 0.27387260, dibujado a escala,
considerando las mismas unidades tanto para las distancias
evolutivas como para la longitud de las ramas, siendo estas el
número de sustituciones de bases por sitio, calculadas por el
método de máxima probabilidad compuesta e involucrando 14
secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas
fueron 1ª + 2ª + 3ª + Sin codicación. Todas las posiciones
ambiguas se eliminaron con la opción de eliminación por
pares, obteniéndose un total de 599 posiciones en el conjunto
de datos nal.
Jiménez et al., 2022
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Figura 9. Árbol logenético derivado de la secuencia de la región EF1, usando el algoritmo “Máxima verosimilitud”. Los
recuadros muestran el código Genbank de la accesión tipo a la que más se parecen
Figura 10. Árbol logenético derivado de la secuencia de la región EF1. La construcción del árbol logenético se utilizó
el algoritmo “Vecinos cercanos”. Los recuadros muestran el código genbank de la accesión tipo a la que más se parecen
Sobre el análisis de secuencias y el porcentaje de
identidad, este pudo variar entre las especies debido a
posibles modicaciones o cambios en su ADN, sean estas
transversiones (polimorsmos de un único nucleótido
“SNP”) mutaciones y transiciones; pudiendo ocurrir de
manera espontánea por un posible error en la replicación,
despurinización, daños oxidativos en el ADN, o por la
exposición de radiación ultravioleta, radiaciones ionizantes
o fungicidas con capacidad mutagénica (Palero & Crandall,
2009) citado en (Guamán, 2018).
Son estas mismas diferencias las que ubicaron a los
aislamientos en ramales de diferentes especies dentro del
árbol logenético, pero que, tanto en el algoritmo de máxima
verosimilitud como el de vecinos cercanos, se ubicaron en el
mismo orden. Esto asegura los resultados obtenidos ya que
según Saitou y Nei (1987), la unión de vecinos o neighbor
joining es un método de agrupación de abajo hacia arriba para
la creación de árboles fenéticos, que produce un árbol nal
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Ciencia y Tecnología. 2022. 15(2): 43-52 51
único bajo el principio de mínima evolución, mientras que el
método de máxima verosimilitud determina valores para los
parámetros de un modelo. Éstos, se encuentran de tal manera
que maximizan la probabilidad de que el proceso descrito por
el modelo produzca los datos que realmente se observaron
(Brooks, 2018).
Lo expuesto anteriormente, así como la abundancia
de relatos de estudios sobre Botryosphaeriaceae, permite
concluir que las especies pertenecientes a esta familia
son particularmente exitosas como colono endofítico
oportunista como lo menciona Slippers y Wingeld (2007).
Schoch et al. (2012) añaden además que, en el orden de los
Botryosphaeriales, son la única familia que integra patógenos
causantes de cancros en tallos. Características que se
presentaron en las ncas de donde se obtuvieron los diferentes
aislamientos y, que justicaría el porqué de la presencia de las
diferentes especies encontradas en el presente estudio, todas
relacionadas con muerte descendente en plantas de cacao.
Conclusiones
En los diferentes cantones de la provincia de Los Ríos,
Ecuador, se encontraron agentes patogénicos pertenecientes
a la familia Botryosphareceae, en plantaciones de cacao con
sintomatología de muerte regresiva, lo cual fue corroborado de
acuerdo con las características morfológicas de sus conidias.
Para el gen ITS, la similitud fue del 100% de identidad en
relación a las secuencias encontradas en la base de datos
GenBank. Mientras que para EF1, las similitudes uctuaron
entre un 99% para Q1 y QUIN1 y 100% para BF1, VAL1 y
M1. Las regiones ITS (Espaciador transcrito Interno) y EF1-a
(factor de elongción alpha), secuenciadas, alineadas y usadas
para la construcción del árbol logenético, identicaron
la especie de los aislamientos de Botryosphareceae, como
Lasiodiplodia theobromae en Quevedo, Diplodia seriata en
Quinsaloma y Botryosphaeria dothidea en Valencia, Buena
Fe y Mocache. Mostrando la ausencia de cualquier diferencia
entre aislados del mismo taxón, al encontrarse dos clados con
notoría politomía entre los aislados.
Bibliografía
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