Madrigal-Valverde et al., 2021

research that the processes must be adapted for in situ work. In conclusion, the generation of information on these reproductive biotechnologies is a fundamental aspect for supporting sparse populations, to avoid the removal of specimens from their natural habitat, or the reintegration into it.

Keywords: assisted reproduction, conservation, semen harvest, cats, andrology.

Introducción

La relevancia de encontrar estrategias para la reproducción de felinos silvestres, tiene como base que las especies de la familia Felidae se encuentran dentro las más amenazadas, inclusive en Brasil (Reis et al., 2006; ICMBio/MMA, 2018). El peligro en el que se encuentran estas especies se debe al crecimiento de la población humana dentro de sus hábitats naturales, lo que consecuentemente provoca cambios en las poblaciones, llegando a fragmentarse (Wultsch et al., 2016). La situación anterior representa una amenaza para todo el ecosistema, ya que al perder comunidades de animales que regulan las poblaciones de especies herbívoras, las cuales a su vez regularizan las poblaciones vegetales, significa un colapso ambiental

a mediano o largo plazo (Reis et al., 2006).

Debido a que los felinos silvestres tienen complicaciones reproductivas que impiden su rápida reproducción tales como una precoz senescencia reproductiva y un bajo número de crías por camada; es requerido el mantenimiento de poblaciones (Moreira, 2017) utilizando como herramienta para ello la reproducción asistida. Por lo anterior desde diversos frentes se han tomado medidas para evitar la desaparición de especies carnívoras en todo el mundo (Pukazhenthi & Wildt, 2004; Micheletti et al., 2011). La información de la fisiología reproductiva básica es esencial para desarrollar y aplicar sistemas de reproducción asistida, como lo son la inducción a la ovulación y la generación de bancos de germoplasma (Swanson et al., 1996). Para que las técnicas de reproducción asistida puedan desempeñar un papel significativo en la conservación es esencial que las técnicas fundamentales de inseminación artificial (IA), transferencias de embriones (TE), crio preservación de semen, primeramente, sean desarrolladas con base en estudios sistemáticos (Moreira, 2017). Por lo anterior, en la presente revisión se compila información de las biotecnologías reproductivas, enfocándose en el progenitor macho, lo cual permite una mayor dispersión del material genético en comparación con la hembra. Dentro de las tecnologías que asisten la reproducción se encuentra la colecta, análisis y crio preservación

del semen, así como la medición de características físicas de los animales correlacionadas con aspectos reproductivos.

Materiales y métodos

Recopilación de información

La recopilación de literatura para la confección de la presente revisión, se realizó en un periodo de 18 meses (junio 2018 - diciembre 2019). Los documentos de texto utilizados se encontraron mediante la plataforma Portal de Periódicos CAPES/MEC de la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), perteneciente al gobierno de la República Federativa de Brasil. El acervo de dicha plataforma cuenta con 266 registros de bases de datos. Cabe resaltar que las palabras claves que se recopilaron en la mayoría de documentos fueron: feline, jaguar, semen y cat. No obstante, se excluyó de esta revisión bibliográfica los trabajos enfocados en felinos domésticos, ya que relataban métodos no aplicables a felinos silvestres, así como trabajos de naturaleza de estudios clínicos de caso.

Revisión de textos: El presente trabajo recopila la literatura científica disponible sobre el tema de biotecnologías reproductivas empleadas para colectar, analizar y conservar el material genético de felinos silvestres. Los esfuerzos realizados por los especialistas en reproducción, para la conservación de las especies, consisten en viabilizar la multiplicación de la especie en condición vulnerable o en peligro de extinción, a través del estudio y empleo de biotecnologías reproductivas en los animales machos. Esta revisión bibliográfica se encuentra dividida en las siguientes ocho secciones: inicialmente se introduce el tema de la i) Reproducción asistida; posteriormente se abarcan los contenidos de evaluación reproductiva del macho, contemplando la ii) Biometría corporal y testicular, así como los iii) Análisis Complementarios y por último, se explica de manera amplia el trabajo realizado alrededor del mundo acerca de las biotecnologías reproductivas de vi) Colecta del semen de felinos, vii) Acondicionamiento y análisis de semen de felinos, refrigeración y crio preservación del semen, viii) análisis seminal computarizado y citometría de flujo.

Resultados

Reproducción asistida: Los recientes avances en la reproducción del gato doméstico, demuestran la manera en que estas metodologías pueden ser empleadas en programas de conservación de la vida silvestre (Goodrowe et al., 2010). Los métodos para

la colecta de semen se basan en la utilización de una vagina artificial y un electroeyaculador. Estas técnicas permiten la evaluación de la calidad seminal dentro de los cuales se encuentran parámetros como volumen, motilidad celular, concentración de espermatozoides y morfología celular. Adicionalmente se han utilizado sistemas de análisis computarizados para la evaluación del espermatozoide felino y análisis seminal (CASA) (Root, 2010; Madrigal-Valverde et al., 2019).

La reproducción asistida se ha convertido en la herramienta elegida para combatir la infertilidad animal (Mattos, 2001). El desarrollo y aplicación de nuevas técnicas para la reproducción asistida, ayuda a mejorar el manejo de la población y la crianza de felinos latino- americanos en cautiverio, logrando enfrentar algunos de los desafíos de manejo y conservación (Moreira, 2017). Estos avances fortalecen una ruta alternativa para el intercambio de material genético de poblaciones entre países (Swanson & Brown, 2004). No obstante, para que estas técnicas sean empleadas plenamente se requiere una mejor comprensión de la reproducción de los felinos silvestres, con el fin de obtener el desempeño reproductivo buscado (Erdmann, 2005; Micheletti et al., 2011). En Latinoamérica los programas de entrenamiento en ciencias reproductivas contribuyen con investigaciones básicas y establecen estudios científicos altamente calificados para la conservación de los felinos silvestres (Swanson & Brown, 2004). Entre las biotecnologías que pueden ser utilizadas para la preservación y reproducción de animales en peligro de extinción se encuentran la inseminación artificial (IA), las transferencias de embriones (TE), la fertilización in vitro (FIV), la crio preservación, la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), el clonaje y la colecta de folículos pre-antrales (Mattos, 2001; Micheletti et al., 2011).

En cuanto a las biotecnologías reproductivas empleadas en felinos silvestres figura la colecta y refrigeración de semen en Leopardus tigrinus (Angrimani et al., 2017; Juvenal et al., 2008; Angrimani et al., 2017); la colecta de semen asociada a dosaje de andrógenos en sangre y en heces para Leopardus pardalis, L. wiedii y L. tigrinus (Morais et al., 2002); la crio preservación de semen en L. tigrinus (Erdmam, 2005; Baudi et al., 2008) y colecta de semen en jaguares por diferentes técnicas de colección (Morato et al., 1998; Morato et al., 2001; Araujo Paula et al., 2008).

Para el empleo de tecnologías como IA se requiere la colecta de semen de calidad (Howard & Wildt, 2009). Para este procedimiento en felinos, generalmente, ha sido utilizada la electroeyaculación y la técnica reciente de colecta farmacológica asociada al cateterismo uretral (Moreira, 2017; Araujo et al., 2018; Madrigal- Valverde et al., 2019). Debido a la importancia de la

calidad del material genético del animal macho, el cual es predominante debido a la dispersión del material genético, el semen debe ser recolectado y examinado de una manera cuidadosa.

Evaluación corporal y testicular: La evaluación corporal y testicular puede realizarse mediante la biometría corporal y morfofisiología corporal, ya que los anteriores parámetros tienen asociaciones con aspectos de comportamiento reproductivo y por tanto con el desarrollo de protocolos de reproducción asistida (Sarti et al., 2009). En un principio debe examinarse la condición general del felino (Morato et al., 2001), el peso corporal registrado (Gañán et al., 2009; Morais et al., 2002) y los parámetros biométricos medidos, tales como largo de cola, largo de la cabeza más el cuerpo, largo total (Auricchio & Salomão, 2002) y el diámetro torácico (Sarti et al., 2009; Madrigal-Valverde et al., 2019). Adicionalmente se debe realizar una evaluación específica del sistema genital, con la inspección del pene y el prepucio del felino (Morais et al., 2002). Finalmente, deben ser examinados los testículos, evaluando su consistencia (si son flácidos, normales o túrgidos) y sus dimensiones medidas con un pie de rey (largo, ancho, espesor). Estos parámetros son combinados para obtener el volumen testicular (Barone Roelke et al., 1994; Morato et al., 2001; Morais et al., 2002; Barros, 2005; Gañán et al., 2009; Azevedo et al., 2010) por medio de la fórmula de la elipse. El grosor de un pliegue doble de la piel del escroto también debe ser medida y descontada de las dimensiones testiculares (Sarti et al., 2009; Azevedo et al., 2010).

Los resultados de la biometría testicular se encuentran altamente correlacionados con el peso real testicular y son empleados para estimar la masa corporal ubicada en las gónadas (índice gonadosomático) (Sarti et al., 2009). Adicionalmente, se ha observado que algunos parámetros de biometría testicular se encuentran asociados a características seminales (Macedo et al., 2011), tales como la producción espermática (Peixoto et al., 2016).

Análisis para la evaluación complementaria: En la evaluación de felinos silvestres reproductores, las características endócrinas son rutinariamente evaluadas, entre ellas se encuentra la evaluación de testosterona sérica y metabolitos sanguíneos como el cortisol (Barone et al., 1994; Barros et al., 2016; Gañán et al., 2009; Morais et al., 2002; Morato et al., 2004), así como la detección y medición de andrógenos en muestras fecales (Morais et al., 2002; Morato et al., 2004). Otro de los análisis complementarios que se realizaron es la ecografía y con ella se busca determinar características del testículo y del epidídimo (Ahmad

&Noakes, 1995). El uso de ultrasonido también es una herramienta importante, por ejemplo, para la

Madrigal-Valverde et al., 2021

evaluación del tracto reproductivo masculino del felino, debido a que con la información obtenida por medio del ultrasonido se puede confirmar la anatomía normal o determinar condiciones patológicas de este (Davidson & Baker, 2009).

Colecta de semen en felinos: la colecta de semen es el inicio primordial para conservar y almacenar el material seminal. En felinos puede ser utilizada la electroeyaculación, la vagina artificial, el cateterismo uretral, el lavado de la vagina poscoital y la recuperación de espermatozoides de la cola del epidídimo posterior a la orquiectomía o muerte del animal. La colecta de semen mediante un electroeyaculador es el método más utilizado en felinos silvestres (Martins & Justino, 2015). En este proceso se requiere de un equipo costoso; además, existe el riesgo de contaminación por orina (por relajamiento del colovesical) (Martins & Justino, 2015), además se da la dilución del semen por secreción prostática y la mayoría de los animales llegan a presentar una fuerte contracción muscular (Lueders et al., 2012). El protocolo de estímulos eléctricos utilizados para la electroeyaculación contempla tres series de estímulos: 30, 30 y 20, de 2-6 voltios, con un descanso entre series de 10 minutos. Por otra parte, la cateterización uretral es una técnica de reciente desarrollo para la colecta de espermatozoides felinos, esta consiste en la introducción de una fina sonda uretral, posterior a la sedación del animal (Zambelli et al., 2010; Martins & Justino, 2015; Swanson et al., 2017), en asociación con un alfa 2- adrenérgico (analgésico y sedante). De esta manera se logra la estimulación de un adrenoreceptor en los ductores deferentes y se produce la eliminación uretral de espermatozoides de alta calidad, evitando la contaminación por orina, comúnmente encontrada en la electroeyaculación. Dicha técnica ha sido exitosa para la colecta de semen en Panthera onca, Leopardus wiedii y Herpailurus yagouaroundi (Araujo et al., 2018; Madrigal-Valverde et al., 2019).

Acondicionamiento y análisis seminal convencional: En cuanto al semen del felino, este debe ser colectado en un recipiente estéril y mantenido a 37 °C (Tipkantha et al., 2017). Los parámetros macroscópicos de aspecto y coloración del material deben ser inmediatamente examinados, así mismo el volumen de la eyaculación debe ser medido por medio de un tubo graduado o micropipeta (Barone et al., 1994; Morato et al., 1998; Paz et al., 2000; Morato et al., 2001; Gañán et al., 2009; Zambelli et al., 2010). El pH seminal debe evaluarse inmediatamente posterior a la colecta, mediante el uso de cintas medidoras de pH (Morato et al., 1998; Paz et al., 2000; Angrimani et al., 2017, Tipkantha et al., 2017). Cabe destacar que los protocolos contemplados previamente a la evaluación microscópica son la previa dilución de la muestra y

la centrifugación (Zambelli et al., 2010; Lueders et al., 2012; Angrimani et al., 2017; Tipkantha et al., 2017). Respecto a las características microscópicas espermáticas felinas, tienen especial énfasis la motilidad y la morfología celular, las cuales son afectadas por los protocolos de crio preservación (Luvoni et al., 2003b). En ese contexto las evaluaciones microscópicas del semen en felinos deben incluir el análisis de mortalidad, vigor espermático, concentración y morfología celular (Barone et al., 1994; Morato et al., 2001; Morato et al., 2004; Gañán et al., 2009; Martins & Justino, 2015).

Al igual que en las especies domésticas, la motilidad espermática de los felinos es evaluada colocando una alícuota de 10 μl en un portaobjetos, la muestra es cubierta por un cubreobjetos y observada con un microscopio. Seguidamente se analiza el porcentaje de células móviles y la intensidad del movimiento o vigor espermático, en este caso, utilizando una escala de 1-5 (Barone et al., 1994; Morato et al., 1998; Paz et al., 2000; Morais et al., 2002; Baudi et al., 2008; Gañán et al., 2009; Zambelli et al., 2010; Angrimani et al., 2017; Buranaamnuay, 2017; Swanson et al., 2017). La morfología celular es examinada por medio de un frotis de la muestra, evaluando 200 células en microscopia óptica a un aumento de 1000X, comúnmente es utilizado colorante como la eosina (Jimenez et al., 2013), además de preparaciones húmedas de solución salina y formaldehído (Paz et al., 2000) o glutaraldehído (Barone et al., 1994, Baudi et al., 2008; Tipkantha et al., 2017). Los defectos observados en las células son clasificados como mayores y menores (Barone et al., 1994; Paz et al., 2000; Gañán et al., 2009; Martins

&Justino, 2015). La concentración espermática del felino puede ser evaluada utilizándose una cámara de Neubauer (Morato et al., 1998; Paz et al., 2000). Por su parte, la viabilidad estructural de la célula espermática se evalúa mediante su permeabilidad al colorante eosina-nigrosina (Angrimani et al., 2017). A su vez, la integridad funcional de la membrana plasmática puede ser examinada con una prueba hiposmótica, ya que se ha establecido que esta prueba es altamente predictiva de la capacidad de fertilización del semen (Comercio et al., 2013).

Refrigeración y crio preservación del semen: Posterior a los análisis macro y microscópicos, la muestra es sometida a una segunda dilución, la cual puede ser realizada en una o dos etapas. Por un lado, en la dilución de una etapa, el diluidor que contiene glicerol es adicionado a la muestra hasta alcanzar la concentración de espermatozoides deseada. Por otro lado, en la dilución en dos etapas, inicialmente se realiza una dilución a temperatura ambiente y la segunda posterior al tiempo de equilibrio (4-5°C) (Buranaamnuay, 2017). El semen procedente de felinos

puede preservarse utilizando métodos que involucren bajas temperaturas, estos son la refrigeración a una temperatura entre 4 y 15 °C y el congelamiento a una temperatura de -196°C. El método de refrigeración provoca un menor daño a las células espermáticas, pero tiene un periodo de almacenamiento corto (72 horas a 5 °C); sin embargo, cabe mencionar que es durante las primeras 24 horas que ocurre el mayor daño a la muestra, como lo es la disminución de los parámetros de movimiento espermático y el aumento en la proporción de alteraciones morfológicas (Martins

&Justino, 2015). La criopreservación por su parte, ofrece un enorme potencial para el manejo de material genético de felinos en extinción (Buranaamnuay, 2017). No obstante, esta técnica requiere del desarrollo de protocolos de criopreservación que sean adecuados para su uso en el campo, así como aplicables en las diferentes especies, cuyo resultado de motilidad y viabilidad espermática pos descongelamiento sean aceptables (Swanson et al., 1996). La criopreservación espermática de felinos presenta dificultades que van desde el momento de la colecta de semen hasta el proceso efectivo de la criopreservación (Martins & Justino, 2015).

Los protocolos para el enfriamiento de muestras seminales felinas, como por ejemplo la recongelación, presentan variación en la dilución de una o dos etapas (Buranaamnuay, 2017) y en la duración de la curva de refrigeración; en la literatura estudiada se encontraron distintas metodologías en las cuales las muestras son mantenidas a temperaturas de 4-5°C por 15 minutos o hasta por 2.5 horas (Baudi et al., 2008; Jimenez et al., 2013; Luvoni et al., 2003b; Paz et al., 2000; Swanson et al., 1996). Luego de someter las muestras a la curva de refrigeración, se inicia la curva de congelamiento (Madrigal-Valverde et al., 2019). El recipiente de almacenamiento utilizado con mayor regularidad para la criopreservación de semen son las pajillas de 0.25 Ml (Paz et al., 2000; Gañán et al., 2009) las cuales son colocadas horizontalmente (Paz et al., 2000; Luvoni et al., 2003b; Buranaamnuay, 2017) en vapor de nitrógeno líquido, por unos 10 a 20 minutos (Swanson et al., 1996). Posteriormente, a una altura de lámina líquida de seis centímetros, son colocados directamente en el nitrógeno líquido a -196°C. Durante la congelación- descongelación del semen felino, ocurren daños importantes en los espermatozoides, lo cual disminuye la capacidad de fertilización, por lo tanto, los daños provocados por el frío representan un factor limitante para la conservación del semen, particularmente de felinos, debido a que frecuentemente determina cambios en la morfología espermática (teratospermia) (Luvoni et al., 2003).

Respecto al descongelamiento del semen, las

pajillas son expuestas a temperatura ambiental por 10 segundos, seguidamente, se colocan en agua a una temperatura de 37-39°C, por un período de 30 segundos a un minuto (Buranaamnuay, 2017; Jimenez et al., 2013; Paz et al., 2000; Swanson et al., 2017). Las muestras descongeladas, pueden ser sometidas a centrifugación, con el sobrenadante aspirado y descartado para renovar el crioprotector (Baudi et al., 2008; Swanson et al., 2017). Luego de ser descongeladas, las muestras se evalúan en relación con la motilidad y el vigor espermático (Paz et al., 2000).

Análisis seminal computarizado: Los sistema de análisis seminal computarizado (CASA) son dispositivos que consisten en un microscopio de contraste de fases, una cámara digital, un digitador de imágenes y una computadora para guardar y analizar las imágenes. Estos dispositivos funcionan capturando el movimiento celular, reconstruyendo las trayectorias de los espermatozoides y la posición de estos en animaciones sucesivas, así mismo calcula varios parámetros de motilidad y concentración simultáneamente (Rijsselaere et al., 2012).

Un recurso de reproducción incluido en la mayoría de estos dispositivos permite la proyección de las secuencias de vídeo del último campo evaluado, ofreciendo un control adicional para validar si todos los espermatozoides fueron identificados y si su trayectoria fue reconstruida correctamente (Rijsselaere et al., 2012). Los análisis de los parámetros de cinética espermática, realizados sin la participación de los CASA, presentan subjetividad variando en el resultado hasta un 60% entre los evaluadores. Por esta subjetividad, fueron desarrollados los CASA; no obstante, el uso del CASA es limitado debido a la necesidad de validar los datos como el control en la calidad y padronización de los análisis (Matos et al., 2008). Los sistemas CASA han sido utilizados para el análisis espermático de carnívoros (Bois et al., 2012; Niżański et al., 2012). El análisis espermático en sistema CASA es implementado en asociación con la citometría de flujo, ampliando la cantidad y la calidad de los datos (Leite et al., 2010), estas pueden ser utilizadas de forma complementaria con la información obtenida por una evaluación convencional (Barrier et al., 2017).

La información generada por los sistemas CASA también se ha utilizado para establecer subpoblaciones espermáticas, ampliando así el conocimiento sobre las características de las poblaciones celulares que componen los eyaculados (Muiño et al., 2008). En felinos, los sistemas CASA fueron utilizados para la evaluación objetiva seminal (Matos et al., 2008; Madrigal-Valverde et al., 2019), pero a su vez, son pocas las investigaciones que utilizan este sistema,

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a pesar de producir informaciones innovadoras para el estudio reproductivo de estas especies (Filliers et al., 2008; Sienieniuch & Woclawek-Potocka, 2008; Stachecki et al., 1993; Prochowska et al., 2015). En relación con lo anterior, cabe señalar que ha sido reportado el análisis del semen del gato doméstico y felinos silvestres asociando los sistemas CASA y los resultados de la citometría de flujo (Sienieniuch

&Woclawekpotocka, 2008; Villaverde et al., 2009, Madrigal-Valverde et al., 2019). Igualmente, se han encontrado subpoblaciones espermáticas en muestras seminales del gato doméstico, caracterizadas por su alta velocidad y progresividad (Contri et al., 2012).

Citometría de flujo: La citometría de flujo es una herramienta de análisis de laboratorio que es utilizada actualmente en áreas de las ciencias de la salud, tales como medicina, biomedicina y bioquímica; así como en investigaciones ambientales y biológicas. Una de las ventajas de esta herramienta es el análisis a una muestra representartiva, esto debido a que simultáneamente son analizadas miles de células (Córdova et al., 2016).

La utilización de sondas fluorescentes como yoduro de propidio y naranja de acridina (Partykaa et al., 2010) sirve para estimar la fertilidad espermática, determinando una serie de parámetros que, en conjunto, pueden predecir la fertilidad de la muestra (Barrier et al., 2017; Padrik et al., 2012). En el análisis seminal, la citometría de flujo logra establecer niveles de daño a la membrana plasmática y a las membranas acrosomales

(Leite et al., 2010), adicional a la evaluación de la actividad mitocondrial (Partykaa, Nizańskib & Łukaszewicza, 2010). En los felinos domésticos y silvestres, se tiende a utilizar la citometría para el análisis de la membrana plasmática con el empleo de la sonda de yoduro de propidio, (Sunigama & Meyers, 2012, Sienieniuch & Woclawek-Potocka, 2008). En felinos amenazados, la citometría de flujo es una herramienta de gran utilidad en la evaluación seminal (Spinaci et al., 2007, Madrigal-Valverde et al., 2019). Las variaciones seminales reportadas utilizando citometría de flujo pueden ser empleadas para detectar diferencias entre los eyaculados e inclusive para detectar variaciones estacionales (Malama et al., 2017). La observación conjunta de microscopia convencional, los sistemas CASA y la citometría de flujo, han sido utilizados para el análisis amplio de los parámetros espermáticos (Barrier et al., 2017).

Discusión

La evaluación reproductiva de especímenes machos en felinos silvestres, asociado a la colecta y análisis seminal, utilizando técnicas convencionales y computarizados (Madrigal-Valverde et al., 2019),

permite una mejor caracterización y entendimiento de la andrología de estas especies. Es posible así el desarrollo de metodologías que apuntan a la conservación y multiplicación de los individuos que son amenazados por la extinción.

Dentro de las tecnologías que asisten la reproducción se encuentran la colecta, análisis y criopreservación del semen, así como la medición de características físicas de los animales correlacionadas con aspectos reproductivos. Los principales hallazgos indican que la investigación de metodologías, como la colecta seminal por cateterización uretral, el desarrollo de protocolos de criopreservación y el análisis mediado por computadora del comportamiento espermático, son las biotecnologías emergentes, permiten ampliar el conocimiento sobre la reproducción de los felinos.

No obstante, por una parte se debe considerar para investigaciones futuras que los procesos deben adaptarse para el trabajo in situ. Por lo que, la biometría y el análisis seminal convencional cobran importancia, para el análisis en el campo o propiamente en el recinto del animal.

Por otra parte, uno de los cuidados esenciales para la utilización de biotecnologías reproductivas en felinos silvestres, es que se debe usar con anterioridad un modelo felino, en este caso individuos de gato doméstico, en donde sean cuantificadas y descritas las técnicas, aunado a sus complicaciones, así como sus ventajas. Posterior a la obtención y análisis de resultados en la especie doméstica, los investigadores pueden proceder a adaptar las metodologías en felinos silvestres.

Conclusiones

Debido a la importancia biológica que representan los felinos en su hábitat, así como la amenaza latente de estos, diversos equipos de científicos han unido esfuerzos para aumentar la diversidad genética de los individuos, tanto en vida natural como en cautiverio. Por lo tanto, realizar una colecta seminal de calidad por medio de métodos que provoquen el mínimo estrés en el animal y utilizar métodos de conservación de este semen hasta su depósito en la hembra, son los grandes focos de investigación y desarrollo en relación con este

tema.

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